第七章有机酸发酵.ppt

第七章有机酸发酵,第一节乳酸,乳酸，英文名为(Lacticacid)，学名为-羟基丙酸(-hydrxy-propionicacid)，结构式为CH3CHOHCOOH，相对分子质量为90.08，是一种天然存在的有机酸。HCH3-C-COOHOH,乳酸菌的应用,乳酸是世界公认的三大有机酸之一，自从1780年Scheele发现乳酸以来，乳酸的生产及应用技术得到大规模的提高。L-乳酸、L-乳酸盐及其聚合物广泛应用于食品、医药、农业、化学工业等领域。此外，以L乳酸聚合的聚乳酸(PLA)，凭借其可生物降解，生物相容等特性，越来越受到广泛的研究和关注。,一、乳酸菌及其发酵类型,乳酸菌概述一些能大量产生乳酸的细菌称为乳酸细菌，用于发酵生产乳酸的细菌。常见的乳酸菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属等,1）同型乳酸发酵乳酸为唯一产物的乳酵发酵称为同型乳酸发酵。乳杆菌属（Lactobacillus），链球菌属（Streptococcus）等葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸。此发酵过程中，lmol葡萄糖可以生成2mol乳酸，理论转化率为100%。1葡萄糖2丙酮酸2乳酸+2ATP,乳酸发酵类型,同型乳酸发酵的途径,2)异型乳酸发酵异型发酵乳酸杆菌因缺乏EMP途径中的若干重要酶醛缩酶和异构酶，因此其葡萄糖的降解完全依赖HMP途径。PK途径发酵葡萄糖形成的产物除乳酸外还有乙醇和乙酸。产物为乳酸和其它物质的乳酸发酵称为异型乳酸发酵。异型乳酸发酵是某些乳酸菌利用HMP途径，分解葡萄糖为5-磷酸核酮糖，在经差向异构酶作用变成5-磷酸木酮糖，然后经磷酸酮解酶催化裂解反应，生成已酰磷酸。已酰磷酸进一步还原为乳酸。异型乳酸发酵除乳酸外还有乙醇、CO2、和ATP。肠膜明串株菌（Leuconostocmesenteroides）1葡萄糖1乳酸+1乙醇+1ATP不同微生物异型乳酸发酵产物有些不同,异型乳酸发酵的途径,（二）乳酸发酵生产原料,糖蜜淀粉质原料：大米和薯类，玉米，进行水解。亚硫酸盐纸浆溶液其他可利用的原料菊芋和麦根,1乳酸发酵工艺流程如图7-52发酵培养基的制备碳源：葡萄糖的含量为15%左右。氮源和生长因子可用麦根提供氮源和生长因子磷碳酸钙：10%,（三）传统乳酸生产工艺,3种子制备,1、菌种扩大培养工艺流程保藏菌种菌种活化一级种子二级种子工艺关键点菌种保藏培养基与保藏条件活化：将保藏菌种接种试管中，培养24小时摇瓶种子培养：1支试管接入100mL液体培养基，50度培养2d种子罐培养：大小和级数由发酵罐大小决定，培养基中可加入部分发酵培养基。质量标准,4分批发酵进程控制,1泡沫控制：装料系数控制在0.8%2发酵温度：温度较高，根据菌种的最适生长温度进行控制3pH；发酵开始后pH下降，5后乳酸菌生长受到抑制。碳酸钙进行中和反应，或者添加氨水等。pH控制在5.5-6.54搅拌：乳酸菌耐氧菌，但是适当搅拌可以提高乳酸产量。5补料：葡萄糖的流加,6发酵终点的判断和处理：,残糖：根据原料和经验判断发酵终点乳酸含量：不增加外观：醪液粘稠发酵液温度：不升高注意：结束后用石灰乳调制pH10左右，加热70-90都灭菌，蛋白变性，静止沉淀，保留上清。,5乳酸的提取与精制,（1）发酵液预处理凝聚处理采用磷酸盐絮凝剂沉降过滤板框过滤机过滤，根据色泽选择活性炭脱色。（2）提取工艺：,1、钙盐法提取乳酸,15,发酵液,降温结晶,乳酸钙结晶,硫酸钙,酸解,精制工艺,乳酸,关键步骤:乳酸钙结晶和酸解结晶：缓慢结晶，加入晶种等30231810酸解:加入硫酸至乳酸钙中，生成乳酸和硫酸钙。,1h,1.5h,4h,2锌盐法,在乳酸钙溶液中加入ZnSO4,17,CaL2+ZnSO4ZnL2+CaSO4,ZnL2+H2S2HL+ZnS,第二节柠檬酸发酵,柠檬酸是生物有机体三羧酸循环的中间代谢产物之一，广泛存在于各种生物体中，特别是柠檬、柑橘、菠萝、李、梅、桃、大花果等果实中含量较高，某些植物的叶子，如烟叶、棉叶，以及动物肌肉、骨骼、乳汁、唾液、汗、尿中也存在柠檬酸；,柠檬酸生产简史,1784年，首次从柠檬汁中提取了柠檬酸，并制成了结晶1893年，发现产柠檬酸微生物，柠檬酸霉菌，即桔青酶1923年，美国开始用浅盘发酵法大规模发酵柠檬酸1952年，美国miles实验室首次采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。,柠檬酸的应用及物理性质,柠檬酸又名枸橼酸，学名-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。无色半透明的晶体，或白色或白色结晶颗粒；有强烈酸味，和后涩味。应用；主要为食品行业，酸味剂；缓冲剂，医药工业：柠檬酸盐，补充某些元素和药物；化学工业：高效熬合剂，电镀缓冲液；饲养：改善动物肠道的酸环境。,二柠檬酸发酵生产原料,（一）碳源碳源：淀粉质原料，淀粉水解产物，糖蜜，食品加工废弃物。国外：糖蜜国内：甘薯淀粉（二）氮源及微量元素甘薯淀粉可以不加氮源，其他等淀粉加氮源。（三）无机盐Fe3+,三、柠檬酸生产菌种及生物合成途径,（一）柠檬酸生产菌株大多数微生物均合成理想的菌株:黑曲霉,（二）黑曲霉的柠檬酸生物合成途径EMP途径，HMP途径，TCA循环，CO2固定,柠檬酸合成途径：丙乙酰COA葡萄糖HMP酮柠檬酸酸草酰乙酸,EMP,氧化脱羧,羧化,草酰乙酸,柠檬酸,异柠檬酸,a-酮戊二酸,琥珀酰辅酶A,琥珀酸,延胡索酸,苹果酸,乙酰辅酶A,TCA循环,EMP与HMP,1、通过两种途径葡萄糖被降解2、糖代谢的比例为4：13、糖酸转化率：EMP:1mol葡萄糖2mol丙酮酸1柠檬酸理论转化率为106.7%,黑曲霉糖质发酵柠檬酸,证明生产菌（黑曲霉）中80%的糖代谢走EMP途径,生产菌中存在TCA的酶系，故有TCA存在,草酰乙酸的来源不是由TCA供应，而是由2个CO2固定提供，故CO2固定对柠檬酸合成必不可少。,由于不存在苹果酸脱氢酶,丙酮酸羧化酶,PEP羧激酶,生物合成途径（无碳原子损失）,理论转化率：106.7%,C6H8O7H2O理论转化率：116.7%,能量平衡,EMP中底物水平磷酸化,2ATP,EMP途径,2NADH,丙酮酸氧化脱羧,2NADH,可以满足生产菌的维持能量消耗，不需要消耗C源经TCA来产能,柠檬酸合成的代谢调控,第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK）,柠檬酸对该酶有抑制,生产菌需要解除该抑制作用,NH4+对该酶有活化作用,NH4+有效解除柠檬酸对该酶有抑制，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量,Mn2+的影响：,Mn2+缺乏,菌体的TCA酶活下降,Mn2+缺乏,可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解,NH4+水平升高,减少柠檬酸对该酶的抑制,柠檬酸合成酶，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶柠檬酸合成酶：底物草酸乙酸和乙酰CoA浓度的诱导；顺乌头酸水合酶：Fe2+激活，低的pH值失活异柠檬酸脱氢酶：低的pH值失活另：减少Mn2可以解除柠檬酸对PFK的抑制作用,第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应,第三个调节点：TCA环上调节,柠檬酸合成酶：,许多细胞中该酶是TCA的调节酶，但在黑曲霉中此酶无调节作用,顺乌头酸水合酶：,理论上此酶失活,TCA环阻断,积累柠檬酸,顺乌头酸水合酶需要Fe2+,故在发酵液中添加黄血盐络合Fe2+阻断TCA环，积累柠檬酸,为什么在A.nigar中异柠檬酸不会进一步分解及柠檬酸的积累机制？,归纳：Mn2+缺乏抑制蛋白合成NH4,解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通,柠檬酸合成酶不被调节，并受到底物的诱导，增强了合成柠檬酸的能力。由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。,正烷烃为原料的柠檬酸合成与调节,（1）以正烷烃为原料合成柠檬酸是利用酵母为生产菌种的。（2）首先是将烷烃氧化成相应的脂肪酸，然后经-氧化作用生成乙酰CoA。乙酰CoA(或乙酸、乙醇)经过TCA循环和乙醛酸循环生成草酰乙酸，并且再缩合成柠檬酸。（3）由正烷烃生物合成柠檬酸不涉及CO2固定，但合成柠檬酸的草酰乙酸必须出乙醛酸循环获得。因此，柠檬酸必须转化至异柠檬酸并进行裂解。这是酵母菌利用正烷烃发酵柠檬酸时终产物除柠檬酸外，一定存在异柠檬酸的原因。（4）在酵母的烷烃发酵中，柠檬酸的积累是在培养基氮源耗尽后开始的，由于这时细胞内AMP急剧下降，抑制了NAD异柠檬酸脱氢酶，使柠檬酸的合成大于分解，从而大量积累柠檬酸：至于为什么也积累大量异柠檬酸(有时占总政的50)，可能是与反应中几种酶在细胞内存在的部位不同有关；,四柠檬酸发酵的生产菌种特征,高产柠檬酸菌株的特征在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长不太好，形成的菌落小，形成孢子的能力也较弱能耐受高浓度的葡萄糖并产生酸性淀粉酶能耐高浓度的柠檬酸能抗微量金属元素在摇瓶和深层液体培养时产生大量细小的菌丝球,柠檬酸生产菌的筛选,1、产酸指示剂方法添加万分之一的臭甲酚绿，目的菌落变黄2、透明圈方法加入1的碳酸钙，目的菌落产生透明圈3、对二甲氨苯醛方法加入4的对二甲氨苯醛，目的菌落产生紫色,柠檬酸产生菌的诱变育种,孢子悬浮液的制备r射线处理法高温亚硝基胍处理法,孢子菌悬液的制备,孢子斜面,30（34天）,洗孢子,麦芽汁活化,30（45h）,离心分离,小三角瓶打散,单孢子菌悬液,宣纸或者脱脂棉过滤,射线处理法,剂量伦琴（R)，照射812万R稀释：104倍，取0.1ml，变色圈法进行分离注意：此时，培养基营养要求较为丰富正突变株的特点：1生长较弱，菌落较小。2、菌落颜色变浅和不变3、孢子头着生比较稀疏4、变色圈大,高温处理法,诱变特点：突变率不高促进和检验菌种的稳定性诱变过程安全，简便处理程序：8515min；905min；10012min,亚硝基胍处理,浓度：2mg/ml(溶剂：丙酮，柠檬酸盐）比例：孢子菌悬液：诱变剂（1：4）条件：2628，处理23h对野生菌株可以采用射线高温,亚硝基胍,黑曲酶的保藏,短期保藏斜面中期保藏真空安瓿管长期保藏真空冷冻安瓿管,五、柠檬酸的发酵生产,1、原料碳源：废糖蜜蔗糖淀粉质（甘薯、木薯、马铃薯）氮源米糠，麦芽，NH3，NH3.H2O或（NH4）2CO3金属离子：降低部分金属离子浓度有利于发酵柠檬酸,柠檬酸发酵工艺,静置浅盘发酵工艺液体通风发酵工艺,静置浅盘（表面发酵）工艺,特点：设备简单，投资少，操作简单原料粗放占地面积大，劳动强度高，发酵时间长。原料：糖蜜设备：发酵室，发酵盘工艺：pH为2，温度30，通风，周期为6-8天。,液体通风发酵,发酵工艺流程(见259页）发酵设备不锈钢机械搅拌通气发酵罐。250400m3，国外400600m3，两档搅拌，箭叶搅拌器，喷环装置。发酵条件：温度32，时间112120h，产酸1215，糖酸转化率90104，残糖0.20.5，立即放罐，加热一定温度杀死菌体，再入提取工段。,影响发酵的因素,1温度低温导致长菌和产酸缓慢，高温菌体和杂酸产生过多，甘薯温度3435，糖蜜为28302pH值黑曲霉生长的酸碱度（pH1.511），pH在3以上，产生草酸，5以上产生草酸，故pH为3以下,通风与搅拌在一定范围内，培养基的溶氧分压和产酸成正比。菌丝球作用：有利于菌体对养料的吸收；改善培养基的流体的性质。微量元素：Fe2，Cu2和Mn2,据认为在薯干原料的柠檬酸发酵中，菌丝球的含量在1000个ml以上，菌丝球直径在o1mm左右，菌丝球表面毛糙的发酵产酸必然良好；菌丝球的产生与否以及其结构、数量除了与生产菌株特性有关外，也与接种量、培养基组分、发酵罐结构等有关。接种量大(孢子数多)形成的菌丝球多而小，反之则菌丝球大而少；培养基粘稠度大有利于形成较紧密的菌丝球。,柠檬酸的提取工艺,发酵液的成分：柠檬酸，黑曲霉菌丝体，其自溶物，原料残渣（主要为纤维素），未利用的糖，色素，有机酸。柠檬酸提取过程1过滤去除菌丝体，残渣，及固体物质2化学，物理方法去除柠檬酸以外杂质3、柠檬酸溶液中柠檬酸的精制与结晶,1发酵液预处理预处理是指待发酵液加热至7590，可以及时杀死柠檬酸产生菌及其他杂菌，终止发酵作用，同时使发酵液中部分蛋白质变性、絮凝、降低酵液浓度利于过滤。此外也可能使菌体内部分柠檬酸释放出来。预处理加热时间不能太长，若破坏菌丝球则影响过滤。,2过滤过滤的目的是除去发酵液小各种悬浮的固形物质。目前最常用的是各种板框压滤价和真空带式过滤机，对正常发酵的酵液，只要过滤介质(滤布)选择合适，可不必添加助滤剂就能顺利地进行过滤。,板框过滤时开始阶段不必加压，待滤饼形成、滤速减慢时可适当加压.为了提高过滤收率，完成过滤后用热水再进行一次复滤，或者从过滤机中取出滤渣加水打成浆后再滤一次。,3中和Ca2+在一定温度和pH条件下可与柠檬酸作用生成柠檬酸钙。出于形成的Ca3(C6H5O7)24H2O在水中的溶解度极小，因而能形成沉淀面与其他杂质，如糖、可溶性蛋白等分离。中和剂：生石灰(CaO)、熟石灰Ca(OH)2、氯化钙(CaCl2)以及碳酸钙等最常用的是碳酸钙。,因此中和I00kg的一水柠檬酸需要100的碳酸钙71.43kg。,中和终点的控制可用测量pH法或滴定酸度的方法来确定。中和终点一般控制在酸度o1一o2，若测量pH则以4448为宜(以碳酸钙为中和剂)；,4酸解酸解是指柠檬酸钙与硫酸等强酸作用,在强酸作用下使柠檬酸钙转变为柠核酸游离出来，同时形成硫酸钙(石膏)。由于后者的溶解度极小，难溶于水而形成沉淀，从而达到进一步的分离纯化作用。酸解是一个