DNA的合成与修复VIP

第 章 DNA的生物合成和修复 第一节 DNA 复 制 核酸链的合成方向只有一个：53。在DNA复制过程中，DNA双螺旋的两条链可以同时作为模板；但是在转录时，DNA双链中往往只有1条链能够作为模板链，也有个别例外。RNA聚合酶能够从头合成1条新的RNA链，而DNA聚合酶则需要RNA引物，它不能从头合成1条DNA链。 染色体DNA复制的共同特征有：半保留复制。形成复制叉结构。双向复制。半不连续复制。复制起点具有特殊序列。需要RNA引物。复制的高度忠实性。-DNA复制时，1条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，可以连续复制，这条链叫作前导链(1eading strand)；-而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能分成几个片段合成，故称之为滞后链(1agging strand)。-滞后链片段叫作冈崎片段，它们合成后再连接起来。 -DNA链不能从头合成。在DNA复制开始时必须先合成一小段RNA作为引物(primer)，从它的3羟基开始合成DNA链，这一过程叫作引发(priming)。- 三、E.coli的DNA复制 (一)复制的起始 oriC的9bp区富含A和T，DnaA蛋白的结合使这一区域容易解链(melted)，并形成复制起始的开放型复合物(open complex)，这个过程消耗ATP。dnaC蛋白将dnaB蛋白运送到指定位置解旋酶 DnaB蛋白介导E.coli的染色体DNA必须进一步解旋。复制开放复合物中的每1条单链上各有1个解旋酶分子结合。而形成预引发复合物(prepriming complex)。 *Ecoli的SSB蛋白结合于DNA单链区，以防止DNA再退火(reannealing)，此外，SSB蛋白可以防止形成局部发夹式螺旋阻碍DNA聚合酶前进。 (二)引发 DNA复制都需要引发酶合成RNA引物。这些RNA引物5，端第1个核苷酸通常是pppA，个别为pppG，其长度从几个核苷酸(45个)到十几个不等，它们的前12个核苷酸往往是固定的，后面的可以是任意的核苷酸，也可能从DNA模板链上拷贝。 -引发酶、DnaB和几种蛋白因子形成的复合物叫作引发体(primosome)，它能沿着结合了SSB蛋白的DNA单链定向运动，并在不同位点合成RNA引物。 (三)半不连续复制在E.coli复制叉，前导链的连续合成比较简单。滞后链合成分段进行，需要合成若干RNA引物，DNA聚合酶可以在RNA引物的3端开始合成罔崎片段(Okazaki fragments)，在细菌和噬菌体中它的长度一般为1 0002 000个核苷酸，但在真核细胞中只有100200个核苷酸。当每个新合成的罔崎片断3端到达相邻的另1个罔崎片段的5端时，DNA聚合酶I利用其53，外切酶活性切除后者5端的RNA引物，同时利用它的DNA聚合酶活性填补两个罔崎片段之间的缺口。然后，另1个关键酶DNA连接酶(1igase)将相邻的这两个罔崎片段的3羟基和5磷酸基团连接起来。 DNA聚合酶I，从N端到C端有3个酶促活性结构域依次排列： 53外切酶和35外切酶和DNA聚合酶。在DNA损伤修复时，DNA聚合酶I对于填补缺口(gapfilling)可能是最重要的酶。 DNA聚合酶兼有35外切酶和DNA聚合酶活性。DNA聚合酶能够在DNA的两条链在同一部位都发生损伤时进行DNA修复。 只有DNA聚合酶符合E.coli体内DNA复制的要求,DNA聚合酶在E.coli的DNA复制中是主要的DNA合成酶。 DNA聚合酶亚基具有DNA聚合酶活性，而亚基具有35为外切酶活性，它对于校正功能十分重要。亚基可能起组装作用。其他7种亚基的主要功能是，将核心聚合酶从分配型酶(distributive enzyme)转变成持续型酶(processiye enzyme)。 DNA聚合酶之所以具备持续合成能力，亚基二聚体起了关键作用，它的主要功能是防止核心聚合酶在DNA复制过程中从模板链上掉下来。 (四)复制的终止位点和Tus蛋白E.coli的两个复制叉的汇合点就是复制的终点，在复制叉汇合点两侧约lOOkb处各有1个终止区(terD，A和terC，B)，它们是向1个方向运动的复制叉特异的终止位点(TER sites)， 4个ter序列中都含有1个23bp的共有序列， Tus蛋白(36Kd)识别和结合于终止位点的23bp共有序列，它具有反解旋酶(contrahelicase)的活性，以阻止DnaB蛋白的解旋作用，从而抑制了复制叉的前进。 -复制体(replisome)是在复制叉形成的1种多蛋白复合物，其中包括DNA聚合酶等酶和蛋白因子，它的功能是促使DNA复制。 四、真核细胞的DNA复制 在哺乳动物细胞中发现了5种DNA聚合酶()。哺乳动物的DNA聚合酶和分别负责合成滞后链和前导链，和可能和DNA损伤修复有关，而负责合成线粒体DNA (二)端粒和端粒酶 真核生物线性染色体的末端具有特殊结构端粒(telomeres)。端粒由特异的寡聚核苷酸重复序列组成, 端粒不仅对于染色体的稳定性十分重要，而且为染色体DNA复制所必需。-端粒酶(telomerase)，它是1种核糖核蛋白(RNP)，可以利用自己的RNA分子作为模板，从3端合成并延长滞后链模板DNA。一旦滞后链模板的3端延伸到足够长，就可以完整地合成滞后链的最后1个岡崎片段，产生完整的子染色单体。 某些基因组的DNA复制特征和原核或真核生物的染色体DNA复制明显不同，例如线粒体DNA的D环(D-Loop)复制和噬菌体的滚环(rolling circle)复制。 DNA复制的高度忠实性有赖于多种因素，包括RNA引物的作用，DNA聚合酶的自我校正功能，几种校正和修复系统，以及DNA本身的结构特征(T取代U)等， (二)错配校正系统 E.coli的错配校正系统利用dam基因编码的甲基化酶(methylase)，将DNA所有的 GATC序列中的A在N6位甲基化，新合成的DNA链中的A要晚一些时候才被甲基化。这就为区别新DNA链和模板链提供了基础。 E.coli的错配校正过程始于三种蛋白发挥作用，它们是Mut S，Mut L和Mut H。Mut S可以识别和结合于DNA的错配碱基处,Mut H在新DNA链(尚未甲基化)的GATC的5侧造成缺口(nick)，而MutL将MutS和MutH连结在一起，从而使新合成的DNA链和模板链形成环状结构(looping)。然后，在DNA解旋酶和SSB蛋白等因子参与下，核酸外切酶I切除新DNA链上包括错配碱基在内的片段。最后，由DNA聚合酶和连接酶完成修复。 真核生物新合成的DNA链上往往带有缺口，这种单链DNA缺口本身就是1个信号，可以指导在真核细胞中进行正确的错配校正。 七、拓扑异构酶topo I可以在双螺旋DNA中的1条链上造成缺口，于是缺口两侧的DNA就能够以缺口对面的磷酸基团为中心自由旋转，旋转方向取决于DNA双螺旋中的张力，使张力得以释放。E.coli的topo 只作用于负超螺旋DNA，消除负超螺旋，它对正超螺旋DNA不起作用。而真核细胞的topo I能够使正或负超螺旋都消除。topo可以同时共价结合于DNA的两条链，并将两条链暂时切断，再重新连接。在复制叉前进时，E.coli的topo可以将前方产生的正超螺旋转变为负超螺旋。此外，它还能在DNA双螺旋中引入负超螺旋， 在E.coli中还有1种第二类DNA拓扑异构酶topo，它的功能是将复制产生的两个子染色体从连环体(catenanes)中分离出来。所有的第二类DNA拓扑异构酶都催化连环 (catenation)和去连环(decatenation)过程第二节 DNA的损伤修复 环境的物理或化学因素给细胞中的DNA带来的损伤有以下几种类型： (一)碱基丢失 (二)碱基改变 (三)核苷酸插入或缺失 (四)DNA链断裂 (五)DNA链间共价交联。 二、DNA损伤的几种修复机制 (一)直接修复(directrepair) (二)切除修复(excisionrepair) (三)重组修复(recombinational repair) (四)DNA的倾向差错合成和SOS反应 切除修复可以分为以下3种方式：碱基切除修复。核苷酸切除修复。碱基错配修复(校正)，第三节 逆 转 录 - 所谓逆转录，是指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。 逆转录酶兼有三种