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文档简介

.,1,实验三、目的基因的PCR扩增,.,2,1、掌握PCR反应的基本原理与实验操作技术2、学习PCR扩增仪的使用,一、实验目的,.,3,聚合酶链式反应(PCR)是一种体外DNA扩增技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等特点。PCR工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片段和与其两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸,将该寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增序列片段的特异性和片段长度。,二、实验原理,.,4,PCR（聚合酶链式反应）包括3个基本步骤：模板变性（92-96）：目的双链DNA片段在94下解链；退火（37-65）：寡核苷酸引物在适当温度（50左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对，形成局部双链；延伸（72）：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板，dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。,.,5,由这3个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经2535轮循环就可使DNA扩增达106倍。,.,6,.,7,.,8,ddH2O10PCRbuffer(withMgCl2+)dNTPTaq酶模板DNA引物DNAMarker琼脂糖6DNA上样缓冲液,三、实验试剂,.,9,（一）PCR反应所用溶液融化后置于冰上。依次混匀下列试剂：,四、操作步骤,（1）按序将如下成分混合置于Eppendorf管内a.2.5l10PCRbuffer(withMgCl2)b.0.5ldNTPmixc.0.5l引物1d.0.5l引物2e.1l模板DNAf.1lTaq酶g.19lddH2O,1.PCR反应体系,.,10,（2）混匀（手指轻弹Eppendorf管底部离心2-5s）,（3）加石蜡油少许封住溶液表面,（4）PCR扩增,.,11,2.PCR扩增反应参数设定,.,12,（二）电泳,3.结果观察,取10l扩增产物用1%琼脂糖胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。,.,13,M1C12345678C291011121314M,转gutD/mtlD双价基因植株的PCR检测（秀水11）M:250bpLadderMarker;C1、C2:未转基因对照;1-7:转mtlD/gutD基因不同植株DNA的mtlD基因PCR扩增产物(1.15kb);8-14:转mtlD/gutD基因不同植株DNA的gutD基因的PCR扩增产物(0.88kb),.,14,五、注意事项,1、PCR反应非常灵敏，操作应尽量控制在无菌环境下操作。2、吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换，防止试剂的相互污染。3、PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有必要进一步优化反应条件，包括改变退火、温度和时间，调整Mg2+浓度等。4、
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