血流感染实验室诊断ppt课件

血流感染实验室诊断新进展,2013年4月13日,内容,什么是血流感染？血流感染流行病学特点血培养流程优化提高阳性率分析培养结果减少污染分子生物学方法检测血流感染基于PCR的技术MALDI-TOFMSPNA-FISH,概念,感染炎症+病原体全身炎症反应综合征（SIRS）体温38C或90次/分呼吸频率20次/分，或PaCO212109/L或10%脓毒血症（sepsis）感染+SIRS，血培养可以阳性或阴性重度脓毒血症（severesepsis）sepsis+脏器功能障碍、组织灌注不良和低血压感染性休克（septicshock）,概念,败血症（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合征，是一种严重的全身感染。病原菌主要是细菌，也可为真菌、分枝杆菌等。菌血症（bacteremia）：细菌在血流中短暂出现的现象，一般无明显毒血症状，在国外文献中常与败血症通用。血流感染（bloodstreaminfection,BSI）：败血症和菌血症目前统称为血流感染。,血流感染,医院获得性血流感染原发血流感染实验室证实血流感染（Laboratory-confirmedBloodstreamInfection,LCBI）临床血流感染（ClinicalSepsis）继发血流感染：血培养分离出有意义微生物，而且此微生物与另一部位之院内感染有关。唯不包括血管或血管内导管装置所引起之血流感染。社区获得性血流感染,实验室证实血流感染（LCBI）,标准一：从一次或多次血标本中培养出一种一致的致病菌，而且培养出的病原体与其它部位的感染无关。标准二：病人至少具有下列症状和体征之一：发热（38C），寒颤或低血压，并致病符合下列之一：1.从两次或两次以上不同部位抽血的标本中培养出皮肤寄生菌（如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌）。2.至少一次从带血管内导管的病人血标本中培养出皮肤寄生菌群（如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌），并且主管医生开始了适当的抗菌药物治疗。3.血中抗原检测阳性（如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌或B群链球菌）。与实验室阳性结果一致的症状和体征与其它部位的感染无关。标准三：年龄38C），低温（20/min;白细胞12or10%未成熟中性粒细胞32%患者有1瓶以上CNS阳性，BSI68%，污染12%(p3cm70%酒精脱碘一步法葡萄糖酸洗必泰作用30s，或70%异丙醇消毒后自然干燥，但不适用于2个月以内的新生儿。,急诊血培养污染率与工作量相关,TheUniversityofMichiganHealthSystem急诊血培养大多数由采血员采集，其次为护士和医生采血员:病人=1:9，重症区护士:病人=2:3，其它区域护士:病人=1:4年病人量82521人，采集血培养者7586人11.4%至少1瓶阳性，病原菌阳性率8.0%，污染率3.7%多套培养患者阳性率7.4%，单套培养阳性率5.1%（p0.001），污染率无显著差别（2.2%vs.2.6%）,SchuylerHalverson,etal.JCM.2013online,急诊小时工作量,SchuylerHalverson,etal.JCM.2013online,繁忙时血培养污染率增加,OR=1.23,OR=0.93,SchuylerHalverson,etal.JCM.2013online,抗菌药物治疗与血流感染死亡率,死亡率,Chest115(2):1999,血培养三级报告制度,血培养阳性,终报告,革兰染色,传种培养,初步报告(直接药敏),鉴定菌株,电话报告,鉴定标准药敏,血培养结果回报对治疗的影响,A=AppropriateTherapy(正确治疗)I=InappropriateTherapy(不正确治疗),ClinInfecDis24:584-602,1997,血流感染快速分子诊断,分子诊断不受抗菌药物使用的影响血培养阳性后分子诊断直接使用血标本进行分子诊断快速但不能提供药敏结果,血培养阳性瓶分子鉴定,AntigoneKotsaki,etal.ExpertOpin.Med.Diagn.2012,6(3):209,阳性血培养基于PCR的检测,PCR特异性检测病原特异性PCR特定耐药基因检测：葡萄球菌mecA,肠球菌van细菌载量：肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数广谱检测：PCR扩增特定靶位多态性分析测序后续基因检测种特异性real-timePCR,ExpertOpin.Med.Diagn.2012,6(3):209.CurrOpinInfectDis.2011,24(2):137,qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌,Target：ecfXgene血培养系统：BacT/ALERT，87瓶FA、13瓶FN，涂片均显示G-b对照方法：氧化酶，API20EDNA提取：0.5ml肉汤，离心后加裂解液，水煮法定量PCR：扩增：Oligonucleotideprimers基因特异性检测：fluorescent-labeledhybridizationprobes，152bpfragment,AnnalClinMicrobiolAntimicrob2010,9:21,qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌,33瓶pae，敏感性和特异性均为100%1瓶kpn+pae，由于pae(20CFU/ml)kpn(108CFU/ml)，PCR(-)检测限：将ATCC27853ecfX基因克隆至TOP10E.coli,AnnalClinMicrobiolAntimicrob2010,9:21,阳性血培养基于PCR的检测,最常见病原体多重PCR电泳谱、ELISA杂交、多重Real-timePCRHyplexBloodScreen(BAG,Lich,Germany):多重PCR+ELISA,4.5-6h完成Prove-ItSepsis(Mobidiag,Helsinki,Finland)：多重real-timePCR+微阵列分析，检测多种病原及mecA，3h完成多重Real-timePCR,ExpertOpin.Med.Diagn.2012,6(3):209.,血培养阳性多重real-timePCR,NEWMICROBIOLOGICA,36,65-74,2013,血培养阳性多重real-timePCR,NEWMICROBIOLOGICA,36,65-74,2013,血培养阳性PNAFISH核酸荧光原位杂交,血培养阳性肉汤革兰染色PNAFISH,革兰阴性菌：商品化试剂盒eco/kpn/paeEfa/其它肠球Sau/scnCal/cgl/其它念珠菌报道Salmonellaspp.90minPNAFISH完成,ApplEnvironMicrobiol.2010;76:4476J.Clin.Microbiol.2013,51(4):1301JClinMicrobiol.2009;47:247,MALDI-TOFMS,基质辅助激光解析电离（MALDI）原理：将样品分散在基质分子中形成结晶后直接进样，当用激光照射结晶时，基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子基质会干扰被检测分子质谱峰的大小和浓度；不同类型的分析物选择不同的基质,MALDI-TOFMS,飞行时间（TOF）原理：离子源产生的离子在加速电场获得动能，当进入高真空无电场飞行管道并在此管道内飞行时，质量较轻的离子飞行速度快，早到达检测器；质量较重的离子飞行速度慢，晚到达检测器。因此依据离子的飞行时间与其质荷比平方根（m/z）成正比的关系，通过测定飞行时间，计算出相应离子的分子量。,MALDI-TOFMS操作步骤,MALDI-TOFMS快速鉴定阳性血培养,使用菌落、阳性血培养肉汤鉴定快速：20分钟(从报警到鉴定出结果）MALDI-TOFMS(Bruker)+BACTEC(BD):正确鉴定：193/213阴性菌（包括厌氧菌）(90.61%)，284/319阳性菌(89.02%)80.9%复数菌正确鉴定出一种，7株缓症链球菌鉴定为spnMALDI-TOFMS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMrieux):388个阳性瓶，种正确率91%（包括念珠、厌氧菌）15瓶复数菌：使用通用库多鉴定出一种，革兰染色后使用阴性或阳性库分析，6瓶鉴定出第二种菌,ClinMicrobiolInfect2010;16:1631JClinMicrobiol2010;48:1542,MALDI-TOFMS,VITEKMS(bioMrieux)以16s为金标准，980株临床分离株，ID正确率肠杆菌科97.7%非发酵菌92%葡萄球菌属94.3%链球菌属84.8%HACEK84%酵母菌85.2%,JClinMicrobiol.2010;48:900,PCR/ESIMS,广谱PCRESIMS（电喷射质谱）189阳性血培养和45阴性血培养，种一致率98.7%6例spn标本方法阴性提供定量结果评估病原体载量假阴性率24%：几乎均由混合感染导致5-6h完成检测结合PCR的敏感性和ESIMS特异性可以直接检测标本，不需要培养,ProcNatlAcadSci.2005;102:8012,血标本分子检测,种特异性、属特异性、广谱、多重PCR、微阵列分析血培养阴性的苛养菌，如Bartonellaspp.巴尔通体,Coxiellaburnetii伯氏考克斯体,Mycoplasmaspp.支原体,Chlamydiaspp.衣原体,Ricketssiaspp.立克次体，Tropherymawhipplei,商品化分子生物学检测方法:血标本,SeptiFast(Roche)：multiplexreal-timePCR，种属特异性荧光探针，检测重要血流感染致病菌SepsiTestTM(Molzym)：eubacterialandpanfungalreal-timePCR，a16Sand18SrRNAgene-baseduniversalPCR+sequencing，几乎可以鉴定所有细菌、真菌VYOO(SIRSLab)：multiplexPCR，检测重要血流感染菌，电泳分离扩增片段Plex-ID(Abbott)：eubacterialandpanfungalPCR+质谱，几乎可以鉴定所有细菌、真菌,IntensiveCareMed.2011May,publishonline.,SeptiFasttest检测的病原谱,BMJOpen2012;2:e000392IntensiveCareMed(2010)36:4956,SeptiFasttest评估,IntensiveCareMed(2010)36:4956,SeptiFast与PCT、CRP相关性,LangenbecksArchSurg(2012)397:447455,VYOO检测能力评估,PLoSONE.2012,7:e38916,Sepsis,非感染SIRS,血培养阳性,血培养阴性，其它标本培养阳性,Sepsis,所有培养阴性,VYOO,与微生物学一致性为46.2%仍需改进,PLoSONE.2012,7:e38916,3种商品化PCR检测系统比对,MedKlinIntensivmedNotfmed2013,3种商品化PCR检测系统比对,MedKlinIntensivmedNotfmed2013,分子生物检测血标本,几乎所有与血培养对照的研究，都显示更高的敏感性，但并非所有血培养阳性菌一定能检测出来不可替代血培养！相较于血培养，其高敏感性可以更早地