医微第4次实验.ppt

医学微生物学实验四,南华大学病原学实验中心南华大学微生物学与免疫学教研室,肠杆菌科概述,肠杆菌科（Enterobacteriaceae)指一大群生物学性状相似的革兰阴性杆菌，常寄居在人和动物的肠道内，亦存在于土壤、水和腐物中。肠杆菌科细菌种类繁多，有44个属，170多个种,引起人类感染的菌种不到20个种。,致病菌：伤寒沙门菌、志贺菌、鼠疫耶尔森菌等；机会致病菌：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌等，在宿主免疫力降低或侵入肠外组织时可致病；由正常菌群转变而来的致病菌：引起胃肠炎的某些血清型大肠埃希菌，通过基因转移获得毒位于质粒、噬菌体或毒力岛上的毒力因子基因后而成为致病菌,与医学相关的肠杆菌科细菌分三类：,生物学共性,1.形态结构中等大小G杆菌（不能鉴别）多有菌毛/周鞭毛，少数有荚膜，无芽胞2.培养营养要求不高3.生化反应（重要鉴别依据）乳糖发酵试验（初布鉴定）:致病株(志贺菌/沙门菌等)-大多非致病株,肠杆菌科细菌革兰染色,4.抗原结构（重要鉴别依据）：主要有菌体O抗原和鞭毛H抗原和荚膜抗原。其他尚有菌毛抗原。O抗原H抗原化学本质LPS蛋白质耐热性耐热不耐热（6030min破坏)变异S-RH-O获得加热甲醛诱生的相应AbIgM为主IgG为主,荚膜抗原（型特异性）大肠杆菌：K-Ag伤寒杆菌：Vi-Ag,5.抵抗力较弱，6030min即死；胆盐/煌绿抑制非致病性肠道杆菌6.易变异:通过基因突变或基因转移S-R变异O-H变异耐药性(最常见)毒力变异抗原性变异,生物学共性,实验内容,一、粪便标本中肠道致病菌的分离培养与鉴定（示教，p7375）二、大肠、伤寒、痢疾杆菌的培养及生化（示教）三、肥达试验（自做p3940）,一、粪便标本中肠道致病菌的分离与鉴定,肠道致病菌与非致病菌从形态和染色难以区分，其鉴别主要依靠生化反应和抗原鉴定。故肠道致病菌引起的感染通常需作分离培养，并进行生化和血清学鉴定。此外，沙门菌所致肠热症（伤寒、副伤寒）尚可采用血清学试验（肥达试验）作为辅助诊断。,粪便标本或肛拭子,SS琼脂平板分离培养1824h,其他生化试验：如尿素酶、吲哚试验等,双糖铁培养基培养1824h（初步鉴定）,取可疑菌落,血清学鉴定（玻片凝集反应）,粪便标本肠道致病菌分离鉴别流程,最终鉴定,SS琼脂平板(Salmonellashigellaagar)组成成分：属选择性鉴别培养基，含选择性抑菌剂和鉴别基质。基础成分：蛋白胨、牛肉膏抑制成分：胆盐、枸橼酸钠抑制G+菌生长0.1%煌绿水溶液抑制大部分大肠杆菌生长鉴别成分：乳糖、中性红水溶液鉴别H2S：硫代硫酸钠、枸橼酸铁,发酵乳糖菌落(大肠杆菌菌落呈红色）,不发酵乳糖菌落（肠道致病菌菌落呈无色、透明）,SS培养基,双糖铁-半固体培养基组成成分上层（固体）：蛋白胨、琼脂、乳糖、硫代硫酸纳、硫酸亚铁、酚红下层（半固体）：蛋白胨、琼脂、葡萄糖、酚红,斜面培养基(乳糖),半固体培养基(葡萄糖),指示剂：酚红。,上层：乳糖、H2S下层：葡萄糖、动力,Fe2+,双糖铁-半固体培养基,几种肠道杆菌在双糖铁-半固体培养基中的反应,注：+阳性或产酸；产酸产气；-阴性,血清学鉴定：取双糖铁-半固体培养基细菌与已知沙门菌诊断血清或志贺菌诊断血清作玻片凝集试验，对分离的肠道杆菌作进一步鉴定。,沙门菌诊断血清+分离细菌,生理盐水（对照）+分离细菌,志賀菌诊断血清+分离细菌,生理盐水（对照）+分离细菌,二、大肠、伤寒、痢疾杆菌的培养和生化（示教）,1、在SS平板上的培养特性,2、在双糖铁-半固体培养基上的生长特点,标准管,痢疾杆菌,伤寒杆菌,大肠杆菌,大肠杆菌：乳糖+葡萄糖+动力+H2S-伤寒杆菌：乳糖-葡萄糖+动力+H2S+痢疾杆菌：乳糖-葡萄糖+动力-H2S-,乳糖葡萄糖H2S动力大肠埃希菌-+痢疾志贺菌-+-伤寒沙门菌-+/-+,注：+阳性或产酸；产酸产气；-阴性,三种肠道杆菌的双糖铁-半固体培养基培养结果,原理：为试管凝集反应，是用已知伤寒沙门菌的菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原、甲型副伤寒沙门菌的鞭毛抗原（A）和肖氏沙门菌的鞭毛抗原（B）与待检血清作定量凝集试验，测定待检血清中有无相应抗体及抗体的效价，以辅助诊断肠热症。试剂：伤寒杆菌O12H甲型副伤寒杆菌O12H-A肖氏沙门菌O12H-B希氏沙门菌OH-南方少见,二、肥达试验(Widaltest，p39),引起肠热症的常见沙门菌的抗原组成,O抗原与H抗原的区别,菌体抗原(O-Ag)鞭毛抗原(H-Ag),脂多糖蛋白质,耐热不耐热,S-R变异H-O变异,IgM抗体IgG抗体,Tubes12345678NS(ml)-0.50.50.50.50.50.50.5Serum(ml)1.00.50.50.50.50.50.5(1:20)1:201:401:801:1601:3201:6401:1280-Antigen(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.5（O/H/A/B)Dilution1:401:801:1601:3201:6401:12801:2560-37恒温箱过夜,方法,0.5mldiscarded,为什么加抗原时应从第8管（对照）依次由后向前加（81）？,凝集程度以“+”表示。以产生明显可见凝集现象(+)时血清的最高稀释度作为血清中抗体的效价。,O、H凝集现象的区别：O菌液凝集物：致密颗粒状，不易摇起；H菌液凝集物：疏松棉絮状，轻摇易浮起。,结果观察：,12345678抗O+-抗H+-抗A+-抗B-1:401:801:1601:3201:6401:12801:2560-,结果记录：,抗O1:320抗H1:640抗A1:40抗B1:40,判断参考*正常凝集价有地区差异当抗O1：80抗H1：160有诊断意义抗A1：80抗B1：80,结果解释抗O增加，抗H增加患肠热症可能性大抗O、抗H均不增加患肠热症可能性小但要排除假阴性单抗O增加感染早期、交叉反应单抗H增加预防接种、非特异性回忆反应,结论：,由伤寒杆菌引起的伤寒可能性较大,分析举例：某患者肥达试验结果如下,注意事项：,1、4人/组，吸管加样，加样时