ELISA及相关免疫分析技术PPT课件

09 . 06 . 2020 . 1，酶联免疫吸附试验及相关免疫分析技术，江苏省临床实验室中心徐斌，09 . 06 . 2020 . 2，概述，酶联免疫吸附试验是一种灵敏度高、特异性强、重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存、易操作、客观结果判断等因素，以及其适用于大规模筛查试验和少量样本检测、定性试验和半定量分析的优点，酶联免疫吸附法已广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学、细胞因子等领域。酶联免疫吸附试验的影响因素很多。只有加强质量管理，才能充分发挥其方法论的优势。09 . 06 . 2020 . 3，酶联免疫吸附试验，恩加尔等人于1971年将免疫组织化学免疫分析技术应用于临床检查，并发展成为酶联免疫吸附试验。特点：在聚苯乙烯固体载体表面组装免疫活性物质，形成“免疫吸附剂”酶标记免疫活性物质，化学显色剂放大信号；有两步培养反应和两步洗涤过程。敏感性和特异性相对较高。09.06.2020，4、酶联免疫吸附原理，双抗体(原)夹心法检测抗原(体)的常用方法，针对抗原的两个不同决定簇的两种单克隆抗体分别作为固相载体和酶标抗体检测溶液中的抗原(适用于二价或二价以上的抗原，不能检测小分子半抗原)。09.06.2020，5。抗体检测的间接方法。酶标记的抗抗体(通常是抗人IgG)用于检测与固相抗原结合的抗体。由于干扰，样品必须稀释。竞争法检测抗原或小分子半抗原和抗体。以待测抗原为例，使待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合。结果表明，待检测的抗原越多，与固相抗体结合的酶标抗原越少，显色越浅，两者呈负相关。09.06.2020，以待测抗体为例，包被抗体和待测抗体与添加的恒定量的中和抗原、酶标抗抗体(抗人抗体)竞争结合，待测抗体越多，包被抗体的结合越少，显色越浅。捕获法通常用于检测IgM抗体，包被抗人链，捕获血清中的所有IgM抗体，加入定量特异性抗原与捕获的特异性抗体结合，并酶标记特异性抗体(或抗抗体)用于显色。酶联免疫吸附捕获方法示意图，09.06.2020，9、试剂盒选择，卫生部规定乙肝试剂、丙肝试剂、艾滋病试剂、梅毒试剂和血型试剂必须使用经卫生部生物制品检定所验证合格并贴有防伪标签的产品。试剂应综合评价灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性和经济性。灵敏度：它有两层含义：1)它是试剂检测被测物质最低量的能力；2)试剂在人或大量样品中检测阳性的能力(假阴性越少越好)取决于涂层的全面性。特异性：试剂正确检测不存在的被测物质(无假阳性)的能力取决于包被抗原(体)和标记抗原(体)的纯度和特异性。精密度：酶联免疫试剂一般指其批内变异系数，其值应小于15%；定量试剂还应检查线性范围，09.06.2020，10，CLS II/LA23-aassessingteequality FIMMUN OAssayssystems :放射性免疫SAYSSAYSANDENZYME，fluoroxing，and fluoresponse免疫SAYS SAYS；approvedguideline，11.2: thelowerimiculaldetectionlimitforanassayrestheslowstlevelfananlytethatcanberproductiblydetected . thelaboratoryotestsensitivityidentitcaltothedetection limit；usecutoffvalueClinical临床(诊断)敏感性： theproportionofpatientswithawell-defined clinicaldisorderwhosetestvaluesarepositiveorexceeddefinedecisionlimit(即apositiveresultandidentitionofthepatientshohavedisease)；usepositivepredictivevalue，false-negativeresults，et.al .09.06.2020，11，09.06.2020，12、09.06.2020，13，09.06.2020，14，09.06.2020，15，09.06.2020，16，HBV基因型和血清学亚型，乙型肝炎表面抗原抗原有9种亚型：ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq、adrq-它们仅指示包膜蛋白的氨基酸差异，具有流行病学意义，09.06.2020。17，09.06.2020，18，09.06.2020，19，保存参考材料的国际机构或组织，国家生物标准和控制产品研究所(NIBSC):免疫血清学德国鲍尔-埃利希研究所(PEI):病毒学，免疫血清学等。传染病标记是最完整的。法国国家中心实验室和法国输血协会(SFTS):病毒性肝炎、艾滋病等的血清板。荷兰输血中心实验室(CLB):血型、病毒学、自身抗体等。丹麦国家血清研究所：病毒学、寄生虫、免疫蛋白等。BBI:HBV、丙型肝炎、HIV-1、HIV-2、HTLV-1等小组。09.06.2020，20，稳定性：试剂在特定条件下可储存的时间。通常，破坏性试验用于在37下储存试剂。定期测量试剂的灵敏度、特异性和精密度，直到其质量指数开始下降。一般认为，37下的稳定日相当于4-10下储存一个半月。简单性：在不影响试剂前三项指标的前提下，实验和测定步骤越少越好，定性试验结果判断简单明了。定量测试结果的计算也应该简单。安全性：指试剂对操作者和环境安全、无害、无传染性。经济性：在同等质量条件下，试剂可以通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格相对合理。09.06.2020，21、试剂盒选择、试剂评价需要权威的血清专家组进行检测，一般实验室不容易从健康检查办公室或临床检查中心获得，而且每次试剂评价也很麻烦。试剂可以通过间接信息进行选择。根据试剂生物检验的批次验证报告，了解其质量水平，根据质量计划选择灵敏度或特异性高的试剂；通过询问试剂涂层的组成来判断试剂，例如原材料的来源(基因工程或合成肽)、片段的组合(比例混合或化学合成)、片段的长度等。根据实验室间质评报告中试剂的评价结果，这是客观公正的，因为统计数据全部来自参与医院，反映了某一地区试剂的使用情况。根据权威部门发布的试剂评价结果，了解市场上试剂的质量。09.06.2020，22、标本的收集和保存，可作为酶联免疫吸附试验的标本非常广泛，体液(如血清、血浆、各种积液)、分泌物(如唾液)和排泄物(如粪便、尿液)可作为标本来测定抗原或抗体成分，一般采用血清。标本采集过程中应尽可能避免溶血，因为红细胞破裂会释放过氧化物酶活性物质，干扰垂直可读方法的结果，从而导致假阳性；出于同样的原因，长细菌样本容易出现假阳性。假阳性是由抗凝不完全的标本中纤维蛋白原的干扰引起的。抗凝剂，尤其是肝素抗凝剂，建议尽可能使用。如果标本在冰箱中保存时间过长，很容易引起血清中IgG的聚集，这将加深间接法的试剂背景。一般来说，血清将被放置在4的冰箱中5天以完成测试。如果需要储存一周以上，应该在-20下冷冻。在熔化过程中，应上下颠倒充分混合，避免产生气泡。在1毫克/毫升酶联免疫吸附试验的灵敏度水平下，应尽可能避免标本之间的污染，尤其是不要将同一试管标本用于生化试验。至少，免疫应该在生化测试之前进行。2020年6月9日，23.标本未使用真空采血管分离凝胶进行抗凝处理，09.06.2020。24.内外干扰物质的影响分析。脂肪分解性射频自身抗体甲胎蛋白补体肝素乙二胺四乙酸0 . 1650 . 2000 . 2500 . 2640 . 1860 . 1460 . 1830 . 126 0 . 0230 . 0160 . 0070 . 0290 . 0100 . 0070 . 0190 . 013 a对照0 . 1510 . 1950 . 1950 . 1160 . 160 . 160，09.06.2020，39，报告方法，定量分析使用已知量的标准物质进行一系列稀释、酶联免疫测定和标准曲线绘制。结果以绝对数量或单位表示。酶联免疫吸附试验的标准曲线应与待测样品制作在同一板上。现有酶联免疫定量试剂盒的标准曲线仅在狭窄的浓度范围内形成一条直线，不易获得准确的结果。因此，严禁使用定性试剂盒进行定量分析。09.06.2020， 40，灰色区域概念，将定量分析的正常范围引入定性分析，以建立灰色区域概念，即一氧化碳值以上和以下的一段区域被视为阳性和可疑区域，需要重复实验或试剂置换复检来确定其阴阳，如果仍在灰色区域范围内，则报告为阳性。灰色区域的概念对于血站系统中献血者的筛选尤为重要。有两种类型的灰色区域：1)化学需氧量(1CV)，变异系数是试剂的批内变异系数(一般在15-20%之间)；2)二氧化碳是实验室室内质量控制的中华民国标准。09.06.2020， 41，09.06.2020， 42，确认试验，抗原检测-中和试验抗体检测-riba(recobinantimmunotoblotasay):病毒的各种抗原被单独包被在载体上，例如纤维素膜和尼龙膜，以检测不同抗原的反应性。或WesternBlot:用十二烷基硫酸钠SDS对待测血清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶PAGE电泳，将抗原从抗体中分离出来，将抗原转移到硝酸纤维素膜上，加入抗体，然后与酶或同位素标记的二抗反应显色或放射自显影，以确定结果。09.06.2020，43、质量审核、类型检验(编号唯一性、项目完整性、书写完整性)、仪器检验(状态、校准)、试剂检验(有效期)、质量控制检验(室内和室内)异常值检验(及时与临床联系)、09.06.2020。44，09.06.2020，45，09.06.2020，46，乙型肝炎表面抗原的临床意义乙型肝炎表面抗原-乙型肝炎表面抗原-乙型肝炎表面抗原-乙型肝炎表面抗原急性HBV感染43354早期HBV复制活性急性和慢性HBV感染，活性HBV复制-急性和慢性HBV感染，急性和慢性HBV感染HBV复制过渡-急性和慢性HBV感染，慢性乙型肝炎低复制和异型性-乙型肝炎复制停止或非常低33543354安静乙型肝炎携带状态，乙型肝炎表面抗原非常低，不能被检测到低HBV复制-HBV感染恢复期 -HBV感染恢复期-HBV不同亚型再感染 HBV-DNA整合 -疾病或疫苗接种后免疫，2020年6月9日。47岁，HBsAgA。急慢性肝炎的诊断。献血者和各种血液制品的筛选。急性肝炎的最早预后指标。d .流行病调查。注：1。乙型肝炎表面抗原假阳性血清或肝素抗凝分离不良；第二，乙型肝炎表面抗原假阴性在感染早期容易形成抗原抗体复合物，需要检测抗乙型肝炎病毒抗体和乙型肝炎病毒表面抗原；(2)大多数商用试剂盒检测系统采用多克隆抗体检测乙肝表面抗原的adr和ayw类型，S区的点突变可导致临界测定值或阴性结果；(3)由于慢性病毒携带者(低水平乙肝表面抗原携带者)或HBV感染潜伏期，乙肝表面抗原浓度低于检测水平下限。预后：抗HBs病毒通常在肝炎症状出现后4-6个月出现，通常表明病毒清除和感染恢复。最近的研究发现，5%的抗-HBs阳性患者为HBVDNA阳性。在一些慢性肝炎抗-HBs阳性患者的肝细胞中可以检测到HBsAg、HBeAg和HBV DNA。因此，尽管大多数自然感染患者在抗-HBs阳性转化后预后良好，但他们不应过于乐观，应定期进行审查。b .流行病调查。c .疫苗接种目标的筛选及其效果的观察。接种后，抗-HBs浓度超过10IU/L，表明其具有保护作用。经过4-8周的强化免疫后，其免疫量超过100国际单位/升，即使以后有所下降，其免疫能力仍可维持10年以上。注：中和试验应在假阳性时进行乙肝表面抗原消失几周至几个月(窗口期)后，抗-HBs通常呈阳性，而在乙肝表面抗原消失后，很少呈阳性。在以下情况下可以同时检测抗-HBs和HBsAg:两种HBV亚型在感染前、感染后或同时感染，同时检测抗-HBs和HBsAg通常需要较长时间且浓度较高；抗-HBs假阳性；(3)乙型肝炎表面抗原的抗原性由于编码乙型肝炎表面抗原的基因变异而改变，这种变异不能被原型抗乙型肝炎病毒所消除。血清传染性评估：在慢性乙型肝炎表面抗原携带者中，乙型肝炎表面抗原和HBV-脱氧核糖核酸测试可用于评估感染风险。90%的HBeAg阳性HBsAg携带者可以传染给他们的新生儿，而只有10%的HBeAg阴性或抗-HBe阳性孕妇可以传染给他们的婴儿。b .预后：HBeAg在急性期消失通常伴有ALT降低，这表明病情有所改善；HBeAg在超过12周的时间里持续呈阳性，这表明HBV感染往往是慢性的。更少的无症状HBeAg阳性患者。注：(1)假阴性：由于前C区基因突变，HBeAg不能产生和分泌，血清中HBeAg为阴性。然而，这种突变不影响乙型肝炎病毒的复制，仍然可以形成完整的病毒颗粒。在这种情况下，虽然HBeAg不能被检测到，但慢性HBV感染的炎症反应相当强烈。钩子效应(2)假阳性：包被抗体不纯(含抗-C)，09.06.2020， 50，电化学发光高线性HB