大肠杆菌基因工程PPT课件VIP

基因工程GeneticEngineering，讲师：Li gold，第三章大肠杆菌基因工程，Escherichiacoli(SEM，14000)，第四，工程细菌构建，分析，发酵和产物分离纯化，以及工程菌构建研究内容和技术途径、目的蛋白质分析、表达载体和宿主菌株选择、目的基因的获取和优化、表达载体的构建和分析、转基因和表达筛选、工程菌稳定性分析、表达产品鉴定、工程菌菌株保存、1、目的蛋白质分析：糖化难以表达吗？报复难吗？药效？(1)理化性质() *分子大小：5KD，8805k100k d难表达(融合表达，切割表达)*氨基酸组成：Cys，Pro难表达(使用真核系统)*疏水：疏水难表达(切割表达，使用真核系统)2)生物学特性：膜蛋白难表达(切割表达，切割表达)如果需要可溶性表达，请使用弱启动子，T7启动子最强，PL/PR热休克诱导不能产业化。在蛋白质特性、用途、发酵和分离纯化过程中考虑标签。医学避免氨苄西林，卡拉霉素。4)宿主细菌：满足表达要求(T7RNA酶溶解源？可用性？稀有密码tRNA？)，明确的来源和遗传背景，有益的信息。工程菌构建主要研究内容，3，目的基因获取，分析和优化克隆，合成，请求？工程菌构建主要研究内容，翻译开始站点和结束密码子：头部和尾部不可缺少，中间不能中断GC含量： 70%表达水平低的二级结构：mRNA二级结构抑制翻译的开始或结束。基因或蛋白质的大小：通常小于5kD或大于100kD的蛋白质很难表达。前者融合表达，后者横穿表达(如抗原用途、选择抗原性、良好的表达段)。疏水：疏水，尤其是膜蛋白很难表达。截取表达。N-端和c-端稳定性：人工突变端残基。4，表达载体的构建和分析1)根据选定载体的物理和遗传特性设计和构建PCR扩增目的基因：*在引物中引入适当的酶切部位，防止基因内部部位。* ATG和TAA需要目标基因吗？会适合箱子吗？2)表达载体酶分析：双酶切，多酶切模式分析3)目的基因序列分析：目的基因或表达盒序列分析，工程菌构建主要研究内容，pET21a质粒物理图，pET21a质粒多克隆部位和表达盒，pET32a质粒物理图，pET32a质粒多克隆，M1234，目的基因：VL- ，表达载体：pET32am: maker，1 k blader 1: PCR产品，含引物的NcoI，Hindi ii 2: Hindi ii)2)表达筛选：以表达水平(%)为指标。表达水平(%)=测定总蛋白质中目标产品百分比的方法：SDS-PAGE凝胶扫描分析，工程菌构建主要研究内容，(6，识别表达产品1)基本要求：SDS-PAGE Western-Blot2特殊要求() 基因工程菌遗传不稳定性的表达和机制；工程菌不稳定性的改善策略；大肠杆菌工程菌不稳定性分析；工程菌遗传稳定性分析；工程菌遗传稳定性分析；工程菌遗传不稳定性分析；结构不稳定性；结构不稳定性；重组DNA分子的特定区域缺失；重排、修改；其表观生物学功能的丧失使表达水平下降。重组质粒的逃逸：工程菌部分细胞由于质粒丢失，不再携带重组质粒。重组质粒的宏观逃逸速度：工程细菌培养液中丢失质粒的细胞占总细胞数的比例。宏逃逸率(%)=，非选择性平板殖民地数-选择性平板殖民地数，非选择性平板殖民地数，100，关闭质粒DNA合成途径，开始分解程序，重组质粒逃逸的原因，环境因素诱导的重组质粒泄漏高温，表面活性剂(SDS)，目的基因背景表达产物引起的毒性反应，抗性标记基因过度表达，抗生素消耗过多。重组质粒结构不稳定的原因，宿主细胞的修饰酶破坏了外部源的重组DNA分子，环境因素的突变，宿主细胞的内源转化元件促进了重组分子的缺失重排，提高了基因工程细菌的不稳定性，1，改进了载体宿主系统，质粒细胞，挖空了宿主基因组致死基因(如SSB基因) 选择特定质粒最佳宿主菌株，可控制的克隆体(与扩增和表达诱导同步)，遗传工程菌的不稳定性改善策略，2，应用选择压力，根据载体的耐药性标记，在培养系统中添加适当的抗生素，禁止在药物和食品生产中使用抗生素，营养不足宿主细菌，载体营养标记，培养培养基除外，培养成分，培养成分培养温度限制：培养温度低，有助于重组质粒的稳定性，在非选择条件下连续传递代数世代，工程菌重组质粒存在，结构完整性和功能完整性分析：a，存在：宏逃逸速度b，结构完整性：酶切图分析，序列分析c，功能完整性：表达产品免疫特异性(。 冷冻干燥，储存在-70 。表达载体(质粒)和宿主细菌分别比较稳定。2、master cell bank(MCB):单克隆一次性培养和分离，以准备工作单元库。冷冻干燥，储存在-70 。3，WCB (workingcellbank，WCB):在主细胞库中装扮成单个最小包装甘油培养和生产目的。甘油种类，保存到-70 。，8，工程菌菌种保存(第三种子库)，工程菌生长和表达的主要影响因素工程菌摇瓶水平生长和表达试验工程菌产业发酵工艺研究，工程菌发酵工艺研究，1，培养基2，细菌年龄和接种3，pH值，温度和溶解氧4，诱导时间和回收生长曲线纵座标：生物量(细胞密度OD600，干重量/体积，湿重量/体积)横座标：培养时间(时间)持续时间：停滞持续时间，加速持续时间，对数持续时间，减速持续时间，平展持续时间，衰退持续时间表达曲线纵座标： 氮源：有机氮：酵母抽提物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆无机氮：氨、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等其他：无机盐、微量元素维生素、生物素等，工程菌生长和表达的主要影响因素，2，细菌年龄和接种量的细菌年龄，3，pH，温度和溶解氧pH:影响生长速度、表达水平和产品可用性。生长最佳pH范围为6.8-7.4，最佳pH为6.0-6.5温度。影响增长速度、表达级别和产品可用性。最佳生长37，温度低有利于可用性表达。溶解氧：影响生长速度和表达水平，4，诱导时间和回收时间诱导时间：影响太早的影响生物量，太晚的影响表达水平通常在生长曲线代数中期或代数后期诱导回收时间：影响表达水平太早，影响产品稳定性，可用性和浪费。一般表达曲线平台期间(诱导后3-4小时)回收细菌、主要研究参数：培养基、接种量、pH值、温度、诱导和回收时间等主要观察指标表达水平(%)、生物量、表达产品积累(包涵体性)情况、质粒宏观，工程菌发酵工艺的基本要求和主要问题：工程菌产业发酵工艺研究，工程菌产业发酵工艺，甘油种，试管/摇瓶激活，扩增/种子罐，发酵/发酵机，工程菌发酵工艺，1，菌种激活：参数：培养基， 质粒宏逃逸速度结果：生长曲线，工程菌发酵过程研究的主要内容，3，发酵(扩增培养和表达):参数：种子液体细菌年龄，接种量，培养基，温度，溶解氧，搅拌速度，诱导时间，回收时间指标：细菌浓度， (2)油类和发酵：比较普遍，主要补充碳源，细菌量大，表达水平低，碳源类和时间和速度是关键。*高密度发酵：通过碳源限制和流动添加实现高密度发酵的无机盐介质。3)连续发酵：使用少，表达高，生物总量高，难以控制。，工程菌发酵工艺研究的主要内容，基因工程发酵、表达产品分离纯化工艺研究，分离纯化工艺研究的目的，工作和要求分离纯化工艺设计原理粗提取工艺*精纯主要工作*分离纯化一般策略*基于色谱技术的精纯工艺、分离纯化工艺研究的目的，工作和要求，目的：高效，高效建立粗提取工艺：可从菌体或培养液中获得目的产物，包涵体形态的表达还包括变性和复性处理。 2、建立纯净工艺：去除蛋白质和非白质级杂质，达到纯度指定的要求。3、建立工艺质量管理系统要求：高活性、高产量、高纯度、低成本、表达产品的分离纯化原理，评价各阶段精炼程度的方便敏感的蛋白质检测方法；分离阶段应尽可能少，每个阶段都易于扩大产业。尽可能进行柱层析成像，各阶段之间的样品无需复杂处理。初步分离必须是快速、大规模、纯粹的高分辨率。尽量避免携带有害物质。各阶段应统计如下：产量、纯度、精炼倍数、成型物、离心力、发酵液、发酵液、发酵液、菌体、包涵体、分解液、复性液、菌体、造型物、上清、3、提炼方法产生的杂质清除、分离纯化策略、分离纯化三阶段策略、分离纯化工艺设计考虑、离子交换(Ionexchangechromatography，IEC)速度快、分解率高，适合第一阶段1-2阶段；疏水层析(hydrophocinterectionchromatography，hic)速度快，分辩率高，适合第一阶段1-2阶段；凝胶过滤(GF)分辩率高，商用化和洗脱速度有限，适用于最终亲和层析(Affinitychromatography，AC)，分辩率高，但成本高，1-3级反相色谱(reversed phased phases) 大肠杆菌表达系统的高效表达原理，第一，大肠杆菌表达(生产)系统的优点和缺点，第五，重组蛋白实例，第三章大肠杆菌基因工程，重组人胰岛素，