《生物化学》教学课件-第十七章 基因重组与基因工程

第十七章重组DNA技术RecombinantDNATechnology，第一节概述，一、基因重组和基因克隆，基因重组在体外用酶学方法切断、连接不同来源的DNA，构成新的DNA分子的过程中，也称为DNA重组。 基因克隆是将重组DNA分子导入适当的受体细胞，使其扩增和繁殖，获得大量的同一DNA分子，称为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。 与基因工程实现基因克隆的方法相关的工作统称为重组DNA技术或基因工程。 本章中，重要工具酶基因克隆中常用的载体重组DNA基本原理重组技术在医学和制药工业上的应用，二、目的基因和基因载体1 .目的基因是研究和应用的基因，也是需要克隆和表达的基因。 2、基因载体(vector )是将外来DNA (目的DNA )片段导入宿主细胞的载体，其化学本质是DNA。 运营商必须具备的基本条件，可以独立复制。 具备多个限制酶的识别部位(多克隆部位)。 有遗传表型或筛选符号。 有足够的容量容纳外来DNA片段。 可以导入受体细胞。 常用的载体是(1)质粒(plasmid )存在于细菌染色体外，能自主复制的双链环状DNA分子。 (2)噬菌体，(3)病毒，pBR322质粒，4363bp，拷贝点含有抗氨薄板青霉素标记(ampR)，抗四环素标记(tetR将酶限制在AmpS和tetR基因内噬菌体包含双链DNA分子，全长50kb，65基因，其分子两端分别含有12个碱基的互补单链是天然的粘性末端，被称为COS位点。噬菌体的两种生长途径(形象)、溶菌性生长、溶源性生长是指与DNA和RNA分子的切断、连接、聚合、修饰、逆转录等相关的各种酶系统。 三、工具酶、重要工具酶，1 .限制核酸内切酶(RE )是一种唯一识别细菌产生的双链DNA中特定碱基序列，将其磷酸二酯键水解的核酸内切酶，简称为限制酶或切断酶。 根据限制性酶的作用特性，一般分为、和型，其中常用的是型限制性酶。酶(型)的识别和切断部位的特异性识别和切断48个bp长度，具有回文序列的DNA片段主要是指5 -粘性末端3粘性末端的末端或钝末端回文序列是指该部位的核苷酸序列为180O旋转对称的粘性末端是指内切酶特异性切断的5-粘着末端发生了，c，t，g，c，-，g，g，-，a，c，g，t，c，c t，t，a，a，5，3，a，t，t，c，-，g，-，3，5，EcoR，I，平(头的末端)端/钝端，5-CCC，3-GGG，GGG-3，CCC-5，Sma，I，5-CCC，3-GGG，g 2.DNA聚合酶(最常用的DNA聚合酶有以下4种) DNA聚合酶IDNA聚合酶I大片段Klenow片段TaqDNA聚合酶T4噬菌体DNA聚合酶，(1)DNA聚合酶I，e . 53DNA聚合酶活性53核酸外接酶活性35核酸外接酶活性，DNApol应用，催化DNA缺口移位反应，制备高比活性DNA探针； 第二条cDNA链的合成标记DNA 3的突出末端的DNA序列分析。 E.coliDNApol.催化剂切口的平行移动：t，t，Mg，2，d，n，a，s，e，5，5，3，3，5，5，3，5，3，3，5，5，5 -、32，PdTTP、E.coli、DNAPOLI、(2)Klenow片段(DNApol .大片段)、Klenow片段用途、(1)用补充双链DNA三个末端的标记碱基补充三个末端的cDNA克隆中，用于第二链的合成DNA序列分析。(3)TaqDNApol (耐热DNA聚合酶)，作用特征：1)TaqDNApol催化DNA合成的最佳温度范围7075，2)95以上的高温，30分钟内失去活性，3 )最适合于聚合酶链反应(PCR )。 第二节重组DNA的基本原理(DNA重组基本程序包括以下的过程)分-目的基因和载体的结合-目的基因和载体的结合-重组DNA导入宿主细胞筛-重组DNA的筛选和同定，DNA重组基本程序，DNA的基本程序， 包含重组质粒的菌株的筛选，宿主细胞，染色体，DNA， 重组质粒外源性，包含DNA的“工程菌”，表达产物的分离纯化，一、目的基因的获得(分)，目的基因源1 )基因组DNA的制备2)cdn3 )聚合酶连锁反应4 )人工合成基因的制备，(一)基因组DNA的制备(基因库) 基因组DNA的分离纯化条件：温和EDTA和SDS等存在下RE用蛋白酶k消化细胞，用酚提取大小不同的酶切断片段分离：常用蔗糖梯度和电泳分离分别是用同一RE消化的载体和常用噬菌体载体和质粒载体导入细胞进入宿主细胞内培养扩增。 筛选鉴定用分子杂交、凝胶电泳等方法进行鉴定。 (cDNA(cDNA文库)，(1)合成cDNA的第一条连锁反应体系只有mRNA、逆转录酶、4种dNTP、引物。 引物是与mrna的3末端polyA互补的低聚dT(1218dT片段) (2)合成cDNA的第二链RNase去除模板mrna(3)cdna文库cDNA的两端加接头或连接接头是人工合成的双链低聚核苷酸的两端平头，限制酶联系人是另一个人工合成的双链寡核苷酸的一端为平头，另一端为粘性末端。 cDNA与载体相关。 导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存的cDNA的集合体是cDNA文库。 目的分离基因mRNA逆转录生成cDNA单链水解去除mRNA，合成cDNA双链水解折回的单链，得到平端双链cDNA，导入宿主细胞克隆，构建cDNA文库，模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚相机在体外经过94改性、54退火和延长72的3个阶段的重复循环(2530次)，扩增目的基因(参见第18章)。 (四)人工合成基因用DNA测序器测定某基因的碱基序列，或由某蛋白质的氨基酸构成反推碱基序列，用DNA合成器用化学合成原理合成目标基因。 一般来说，合成短篇电影，切断DNA，然后把成长的片断连接起来。 二、目的基因和载体的连接(接合)(主要有以下4种连接方式)1)粘性末端连接2 )平头末端连接3 )人工连接法4 )相同多尾连接法，(1)粘性末端连接用同一限制酶切断目的基因和载体，产生相同的粘性末端，通过DNA连接酶作用将两者连接构成重组DNA分子。 (二)连接平头末端的限制酶只能将目的基因和载体DNA切成平头，这种情况下也可以通过T4DNA连接酶的作用同样连接。 (3)通过人工接头方法合成连接子与DNA平头末端连接限制酶切断，生成粘性末端连接，构筑重组DNA。 (四)相同多尾连接法，三，重组DNA导入(转)宿主细胞，无性繁殖体外重组后的DNA导入受体细胞，形成转化子。 并且随着受体细胞的生长、增殖，复制、扩增重组DNA的过程称为无性繁殖。 克隆是无性繁殖系或克隆，进一步从上述无性繁殖细胞中筛选出含有目标DNA的重组体分子。 宿主细胞进行无性繁殖时使用的受体细胞。 以重组DNA导入宿主细胞类型的转化质粒为载体构建的重组体导入受体细胞(原核细胞)的过程； 将以噬菌体、病毒为载体构建的重组体导入受体细胞(原核细胞)的过程导入外来DNA，并将其导入真核细胞的过程。 受体细胞经特殊方法处理后，受体细胞具有接受外来DNA的能力。 这个细胞被称为受体细胞。 受体细胞有原核细胞和真核细胞两种。四、重组DNA的筛选和鉴定(筛选)(筛选含有重组体的阳性菌落，一般有以下方法)1)平板筛选2 )酶切图像筛选3 )通过PCR筛选重组体4)insitu 例如，具有耐药性标志的载体，在转化宿主细胞后，可以在含有抗生素(Amp或Tet )的培养平板上生长的未经转换的载体不能生长。 抗生素平板筛选(插入失活)，(二)限制性酶图谱鉴定，(三) PCR筛选重组体提取少量重组DNAPCR放大电泳鉴定序列分析。 (四)原位杂交技术，五，重组体在宿主细胞中的表达基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入适当的宿主细胞中有效表达，生产有重要价值的蛋白质产品。 第四节重组技术在医学和制药工业上的应用，一、疾病基因的发现1990年美国科学家首先制定了人类基因组计划(HGP )，计划经过15年，到2005年完成，2001年2月12日Since和Nature杂志同时在世界上发表，人类但是，查明人类4万个基因功能的任务会变得更困难。 产品名治疗功能和医药范围1 .人胰岛素治疗糖尿病2 .人生长激素治疗小人症，加速伤口愈合3.干扰素治疗癌，病毒感染4.干扰素治疗带状疱疹、眼结、角膜炎5.干扰素治疗癌，病毒感染6 .人组织纤溶蛋白原活性急性心肌梗塞7 .红细胞生成素(Epo )治疗使肾病性贫血红细胞和血红蛋白水平增加8 .超氧化物歧化酶去除超氧化物，治疗关节炎， 缓解心肌坏死9 .凝血因子治疗a型血友病10 .乙型肝炎疫苗防治肝炎11 .神经生长因子对神经元细胞的生存、生长和分化12 .脑烯皮肤镇痛13 .降钙素治疗骨质疏松症，2 .蛋白质和多肽类活性物质的生产， 基因工程胰岛素生产原理(形象)，3 .基因工程疫苗基因工程疫苗的制造有助于解决传统技术难以解决的特殊病原体疫苗。 例如，(1)乙型肝炎病毒疫苗(HBV )、c型肝炎病毒疫苗(HCV )等(2)人t细胞免疫不全病