细胞凋亡检测

三、细胞生长相关指标的检测方法，细胞计数细胞生长曲线细胞分裂指数克隆形成率，1、细胞计数法，细胞计数法是用细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数，以确定细胞增殖和调节细胞浓度。台盼蓝染色用于检测活细胞的数量。注：台盼蓝染色不包括检测方法。由于死亡细胞细胞膜渗透性的变化，染料可以大量进入但不能排出，因此细胞被染色。然而，活细胞可以抵抗染色，因此不容易染色。台盼蓝染色法，心肌细胞原代培养。结果细胞密度分析细胞数/ml=(4个大细胞之和/4)104稀释倍数细胞存活率(%)=未着色细胞总数的100%。2 .细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是观察同代细胞的增殖过程。根据细胞生长曲线分析细胞增殖方法一：将同一代细胞接种在同一规格的培养瓶中，培养后每隔24小时取出几瓶细胞计数，以培养时间为横坐标，以不同时间的细胞数为纵坐标，得到细胞生长曲线。方法2: MTT比色法。细胞分裂指数，它是细胞增殖旺盛程度的指标；根据1000个测试细胞中分裂细胞的数量计算。方法：染色后，血细胞计数器计数细胞分裂指数=细胞分裂相数/细胞总数(1000) 100%。4.克隆形成率。通过克隆形成率计数的细胞必须是贴壁和增殖细胞，反映了细胞群体依赖性和增殖能力。各种细胞克隆的形成速率非常不同。一般来说，第一代细胞克隆的形成率较低，传代细胞系的形成率较高。二倍体细胞克隆形成率低，转化细胞系强。正常细胞克隆形成率低，肿瘤细胞强。方法克隆形成率=克隆数/接种细胞数100%注：细胞应分散良好，不应有细胞团，接种密度不应过高。细胞生物学活性的化学检测MTT比色法细胞蛋白质含量的测定细胞蛋白质掺入试验合成的3H-亮氨酸掺入试验3H-TdR掺入试验细胞1合成的DNA MTT比色法原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将MTT黄溶液还原成不溶的蓝紫色晶体并将其沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。二甲基亚砜(DMSO)和酸化异丙醇或酸化十二烷基硫酸钠能溶解细胞中的紫蓝色晶体。通过酶联免疫吸附测定法在490，570，570纳米波长下测量光吸收值(OD)，其可以间接反映活细胞的数量。在一定的细胞值范围内，形成的四甲基偶氮唑晶体的数量与细胞数成正比。该方法已广泛应用于生物活性因子的活性检测、细胞毒性实验、抗肿瘤药物筛选和肿瘤放射敏感性测定。(1)将单细胞悬液接种在96孔培养板上；103-104个细胞/孔，每个孔的培养基总量为200 L，培养在37的5% CO2培养箱中进行。在一段时间内(培养时间根据实验目的确定)(2)加入2毫克/毫升的MTT溶液(50微升/孔)；继续培养3小时。(3)将孔中的培养液吸出后，加入二甲基亚砜溶液(150L/孔)，将培养板放在微孔板摇床上振荡10分钟以溶解晶体。(4)每个孔的外径值用微孔板读数器检测(检测波长为490或570纳米)。记录结果并绘制细胞生长曲线。2.细胞蛋白质含量测定法(考马斯亮蓝测定法)。原理：考马斯亮蓝在酸性溶液中与蛋白质结合后，在595nm波长处表现出最大吸收，其吸收值与蛋白质含量呈正相关。该方法主要用于测量酶、受体和细胞外代谢物的比活。3。细胞蛋白质合成的3H-亮氨酸掺入实验。原理：细胞在合成蛋白质时需要摄取外源氨基酸。用核素标记的氨基酸，例如，4。3H-TdR掺入实验用于细胞DNA合成。原理：胸腺嘧啶核苷是脱氧核糖核酸的一个特殊碱基，也是脱氧核糖核酸合成的基本物质。核苷3H标记的TdR，即3H-TdR，被用作DNA合成的前体，并被结合到DNA合成和代谢过程中。通过测量细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢和细胞增殖。(1)凋亡的概念：凋亡是细胞按照自己的程序结束生命的过程。它具有特征性的形态和生化变化，并且是由基因控制的个体细胞的自主和有序死亡。也就是说，基因控制细胞有目的和选择性的自我灭绝过程。这种消除机制是确保生命进化的基础。(1972)1965年，发展生物学家洛克申在研究中国乔木的发展时首次提出程序性细胞死亡的概念。1971年，澳大利亚生物学家克尔用收缩死亡来区分典型的细胞坏死。克尔等人于1972年在英国癌症杂志上发表了一篇论文，首次提出了凋亡的概念。宣告了对细胞凋亡真正探索的开始。脱氧核糖核酸降解和内源性核酸内切酶的参与。(1987)c，蛋白水解酶激活的研究(1995)d，细胞膜的变化(1997)e，线粒体和分子生物学的变化(1998-)1)相关基因和调节2)信号转导3)各种分子及其相互作用和相互关系4)疾病机制的阐明和新疗法的探索和出版。(2)细胞凋亡的研究历史，科学2005年第7期；310 (5745) :6-7。像秋叶凋零，告别生命的辉煌；无数的攻击和诱惑照亮了这个过程，迫使细胞一步一步走向生命的尽头。啊，活性氧物种无处不在，钙波惊吓岩石和裂缝堤岸，线粒体一点一点地稀释生命之光。细胞遇险时，你平静不乱，DNA碎片划破，梯子直往天堂；细胞体聚集在一起，将有尊严的生活集中在小身体上。分离了日夜相处的伙伴，告别了快乐而美好的时光；所有这些都融入了邻近的细胞体，为书写生命的另一个篇章留下了空间。正常、凋亡、坏死、(3)、凋亡和坏死、凋亡和坏死的主要分化(形态学)、接受凋亡信号和凋亡调节分子之间相互作用的蛋白水解酶(半胱天冬酶)的激活和凋亡的级联反应、(4)、细胞凋亡的过程和机制、(5)、凋亡的主要信号途径、线粒体激活的模式。osmosticdisequilibriumleadingtonexpansionoftheomarixspace，organellarswelling，and subequentuptureoftheouter membrane，thetherenvisionsopeningofchannelsintheooutermembranethusreleasingcytocfromthenterminarsmoapescapeofmitochondrintothecytool .多细胞凋亡的注意通路，信号传导通路，线粒体，时间性病变，(5)，细胞凋亡的检测方法，凋亡的形态学检测，磷脂酰丝氨酸转化分析(AnnexinV方法)，线粒体膜势能(MT)的检测，通过TUNEL法检测半胱天冬酶-3活性，白细胞检测凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析，凋亡检测，1。细胞凋亡的形态学检测，光学显微镜和倒置显微镜未染色细胞：凋亡细胞体积减少，变形，细胞膜完整但出现泡沫现象，凋亡小体在细胞凋亡后期可见。染色细胞：常用姬姆萨染色、雷司令染色和苏木精染色。凋亡细胞的染色质浓缩并被边缘化，并以新月形附着在核膜周围。荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般利用核染色质的形态变化来判断细胞凋亡的进程。常用的DNA特异性染料有：HO、Hoechst33342HO，Hoechst33258DAPI .电镜观察、光学显微镜观察、细胞凋亡细胞核形态变化(488 nm 400)，电镜观察，凋亡细胞体积缩小，胞浆浓缩。凋亡期细胞核内的染色质高度卷曲，有许多称为空泡的空泡。在细胞凋亡的后期，细胞核分裂成碎片，产生凋亡小体。正常细胞，凋亡：凋亡小体，2。磷脂酰丝氨酸外翻分析法。磷脂酰丝氨酸通常位于细胞膜的内侧。在细胞凋亡的早期阶段，PS可以从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面并暴露于细胞外环境。膜联蛋白-V是一种钙依赖的磷脂结合蛋白，分子量为3536KD，能以高亲和力特异性结合PS。膜联蛋白-V用荧光素(FITC，右-平)或生物素标记，标记的膜联蛋白-V用作荧光探针。流式细胞仪、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。磷脂酰丝氨酸外翻分析(膜联蛋白法)，不同凋亡阶段的分化，膜联蛋白-V细胞凋亡检测，DNA含量-PI，膜联蛋白-V，膜联蛋白-FITC荧光，PI荧光，细胞培养时间-1，细胞培养物-CSF-游离培养基，凋亡配体-膜联蛋白，3。线粒体膜势能()的检测。线粒体荧光染料：罗丹明123、戴克6(3)、JC-1、TMRM等。对线粒体膜电位非常敏感。荧光的增加或减少表明线粒体内膜电负性的增加或减少。NIH 3T3小鼠成纤维细胞六磷酸脲脱氢酶，线粒体膜势能()的检测，健康细胞，凋亡细胞，4。DNA碎片分析。细胞凋亡的主要生化特征是染色质浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段，其在凝胶电泳上显示为阶梯。细胞凋亡的分子机制尚不清楚，但半胱天冬酶在细胞凋亡过程中起着重要作用。细胞凋亡的过程实际上是胱天蛋白酶不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。半胱氨酸蛋白酶水解底物天冬氨酸C端的肽键，因此也被称为半胱天冬酶(取英文半胱氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸、蛋白质的前缀)。半胱天冬酶家族的结构和分类半胱天冬酶亚类蛋白酶：半胱天冬酶是一种来源于单核细胞的蛋白酶，参与成熟，参与凋亡但不发挥主要作用；半胱天冬酶1，半胱天冬酶4，半胱天冬酶5，半胱天冬酶11，半胱天冬酶12，半胱天冬酶13，半胱天冬酶14 .启动凋亡的半胱天冬酶蛋白酶：半胱天冬酶8、半胱天冬酶2、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10。凋亡效应亚类半胱天冬酶蛋白酶：半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7，半胱天冬酶家族的主要成员，半胱天冬酶家族的特征以酶原的形式存在，需要激活：同源激活和异源激活，激活后形成四聚体的蛋白水解酶，和起生物学作用的半胱天冬酶部分，存在于半光酸激活位点的C末端同源区域：启动子酶和效应子酶。半胱天冬酶激活机制：半胱天冬酶激活是一个连续的多步水解过程。虽然分子不同，但它们的活化过程是相似的。首先，水解N-末端前肽和半胱天冬酶前体的大亚基以除去N-末端前肽，然后在大亚基和小亚基之间切割和释放大亚基和小亚基以形成两个或两个活性四聚体。破坏细胞抗凋亡因子的正常活细胞由于核酸酶而失活。这是由于核酸酶和抑制剂的结合。如果抑制剂被破坏，核酸酶会被激活，导致DNA断裂