荧光定量PCR数据分析

应用实时定量PCR和2-CT法分析基因的相对表达量methods 25，402-408 (2001 )ansitionofrelecteneerentitydatausingreal -时间quantitativepcrandthe2-CT methodkennethtj.likek*和托马斯d.schmittgen，1*应用生物系统、Foster City、California 94404； anddepartmentofpharmaaceuticalscience，College of PharmacyWashington State University，Pullman，Washington 99164-6534摘要：分析目前最常用的两种实时定量PCR实验数据的方法是绝对定量和相对定量。 从绝对定量标准曲线计算起始模板副本数的相对定量方法，比较处理过的样本与未处理过的样本的目标转录之间的表达差异。 2-CT法是通过实时定量PCR实验分析基因表达的相对变化的简便方法，即相对定量的简便方法。 介绍了该方法的推导、假设及其应用。 另外，本文还介绍了可能被用于实时定量PCR数据分析的2种2-CT诱导法的导出和应用。关键词：逆转录PCR定量PCR相对定量实时PCR Taqman逆转录PCR (RT-PCR )是一种非常有用的基因表达定量方法(13 )。 实时PCR技术和RT-PCR的结合产生了逆转录定量PCR技术(4，5 )。 实时定量PCR的数据分析方法有绝对定量和相对定量两种。 绝对定量一般是通过对标准曲线进行定量，来确定我们感兴趣的转录本的拷贝数的相对定量法，用于确定经过不同处理的样品在目标转录本之间的表达差异和目标转录本在不同相中的表达差异。绝对定量通常在需要确定抄本绝对拷贝数的条件下使用。 基于实时PCR的绝对定量，有多个报道(6 - 9)，包括已经发表的两篇研究论文(10，11 )。 有时，不需要对转录进行绝对定量，只要给出相对基因表达的差异即可。 显然，x基因经过某种处理，表达量增加了2.5倍，这比该基因的表达从1000拷贝/细胞增加到2500拷贝/细胞更直观。用实时PCR相对定量地分析基因表达，需要对特殊的公式、假说及其假说进行验证。 2-CT法可以通过定量PCR实验计算基因表达的相对变化：2-CT式的导出和实验设计、有效性评价在appliedbiosuserbulletinno.2 (p/n )中介绍过。 文献中也报道了用2-CT法分析基因表达数据的方法(5，6 )。 介绍了该方法的推导、假设及应用。 另外，介绍了2-CT两种诱导方法的导出和应用，也可以应用到实时定量PCR数据分析中。1. 2-CT方法1.1. 2-CT法的导出PCR指数放大的公式如下这里，Xn表示第n个循环后的目标分子数，X0表示初始目标分子数，Ex表示目标分子扩增效率，n表示循环数，C T表示目标扩增产物达到设定阈值为止的循环数。因此：X T是目标分子达到设定阈值时的分子数。 C T、x是目标分子放大达到阈值时的循环数。 Kx是常数。关于内参反应也有同样的公式如果XT除以RT在使用Taqman探针的实时放大中，XT和RT的值由一系列因素决定，包括探针具有的荧光报告基、探针序列对探针的荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度、荧光阈值的设定。 因此，常数k不一定等于1。假定目标序列和内参考序列的放大效率相同：或者：XN表示均匀化的初始目标分子量CT表示目标基因和内标基因的CT值的差异(CT、X-CT，r )，整理了上式最后，书q的任意XN除以参考因子(calibrator，cb )的XN，得到以下公式在这里对于小于150bp的放大片段，如果Mg2浓度、引物进行了适当优化，则放大效率接近1。 因此，目标序列的量在通过内均匀化处理后对参照因子1.2. 2-CT法的假设和应用为了使CT的计算方法有效，目标序列和内参考序列的放大效率必须相等。 看两种反应是否具有相同的放大效率的方法是看他们的模板浓度梯度被稀释后放大产物CT如何变化。图1显示的是cDNA样品100倍稀释范围内的实验结果。 用GAPDH和c-myc特异性荧光探针和引物对每个稀释样品进行了扩增。 计算c-myc和GAPDH的平均CT值以及CT值，用cDNA浓度梯度的log值绘制CT值，如果所得到的直线梯度的绝对值接近0，则说明目标基因和内标基因的放大效率相同，可以用CT法进行相对定量。 在图1中，由于直线的斜率为0.047，因此假设成立，CT法可以用于数据的分析。 如果两个扩增反应效率不同，可以用标准曲线和绝对定量的方法进行相对定量或重新设计引物，优化反应条件，使目的序列和内参序列具有相同的扩增效率。1.3. 2-CT内坐标和参照因子的选择使用内含子基因目的是为了在逆转录反应之外使RNA均匀化。 标准的看家基因一般可以作为内标准基因使用。 适合于实时PCR反应的内标基因为GAPDH、 -actin、2 -微球蛋白、rRNA。 当然，其他看家基因也同样被用作内标。 我们建议在将某基因作为内标应用之前，确认该基因的表达不受实验处理的影响。 验证实验处理是否影响内标基因表达的方法在2.2部分叙述。2-CT法中参照因子的选择根据基因表达定量实验的类型而决定。 最简单的设计是将未经处理的样本作为参考因子。 经过内标基因的均匀化处理后，目标基因的表达差异用处理样品对未处理样品的倍数来表示。 对于未处理的参考样品，设CT=0，20=1。 因此，根据定义，未经处理的样本的倍数变化为1。 另外，处理过的样品相对于参考因子基因表达的倍数为2-CT。 同样的分析也可以用于不同相的基因表达差异，但在这种情况下，通常选择0时的样品作为参照因子。有时，并不比较不同处理样品基因表达的差异。 例如，也有想看某器官的特定mRNA的表达。 在这种情况下，参考因子可能是该mRNA在另一器官中的表达。 表1显示的是脑和肾脏总RNA的c-myc和GAPDH转录本的CT值。 在这个例子中，脑被人为地选择为参考因子，通过计算获得肾脏c-myc表达量被GAPDH校正后对脑的表达量的结果。 相对定量法可以用于这种组织之间的比较，但结果的生物学解释相当复杂。 不同种类的细胞中的目标和参照转录本的单一相对量变化，在任何特定的组织中都可能存在。1.4. 2-CT法的数据分析通过实时定量PCR得到的CT值可以容易地输出到Microsoft Excel这样的显示程序中。 为了说明数据分析过程，现在给出了基因表达定量的实验数据和样品清单。 通过-actin均匀化处理，我们监测目标基因fos-glo-myc的表达变化。 在8h的时间范围内，各时刻采集3个重复样品，各自的样品在cDNA合成后进行定量PCR，数据分析用于式9Time x表示任意时间点，Time 0表示由 -actin校正的1倍量的目的基因表达。0时的目标基因和内标基因的平均CT (参照图2 第8栏)用于式9。 根据 -actin均匀化处理，用式9计算各样品的目标基因表达相对于0时的倍数(参照图2的第9栏)。 根据每时刻取的3个重复模式求出平均SD、CV。 在该分析方法中，0时刻的平均倍数变化接近于1。 我们发现，通过检查0时的平均倍数的变化是否为1，可以简单地验证3个重复的样本之间是否有错误和误差。 如果得到的结果与1有很大的偏差，表示有计算错误或较高的实验错误。在先前的例子中，在各时刻各取3个独立的RNA样本进行了分析。 因此，逐个样本地进行处理很重要的是通过计算取得结果的平均值。 如果相同的样本是重复的PCR放大，则必须首先计算平均CT。 如何计算平均值，要看目的基因和内参基因是在同一管道中放大还是在别的管道中放大。 表1显示的是目的基因(c- myc )和内参基因(GAPDH )在不同管中扩增的实验数据。 这里不应该比较单个cmyc管和GAPDH管，而应该分别计算cmyc和GAPDH的平均CT来计算CT。 通过标准的指数计算把迭代实验中CT值的估计偏差转换成最终结果的相对量的变化。 但是，其一个难点是，与CT值对应的复制数处于指数关系(参照第4部分)，因此最后计算中的误差通过在CT中减去标准偏差和CT中减去标准偏差来进行评价，求出的数值相对于平均值不对称地分布。 不对称分布是通过结果经指数处理后转换为量的线性比较。用不同的荧光染料标记的探针，可以用同一管同时放大目标序列和内标序列。 表2显示的是靶基因(c- myc )和内标基因(GAPDH )在同一管中扩增的实验数据。 对于任一管，目的基因(c- myc )和内参基因(GAPDH )放大时添加的cDNA的量相同，因此，可以对各管计算CT值，并对这些值进行平均计算。 这里，估计误差值也是不对称的范围，反映了误差按指数函数变换为线性差。在表1和表2中，估计误差在从CT到CT的计算中没有增加，是因为表示了参照基因和检测基因的误差。 将CT、cb作为人设定的常数进行减法运算，得到CT。 以这种方式获得的结果对应于在获得图2中图示的平均之前，将不同重复样本除以其相应的CT值的结果。 另一种方法是将参考基因设定为没有误差的1倍量，在这种情况下，平均CT、cb的误差值被导入到每个样本的CT中。 在表1中，肾脏中CT为- 2.500.20，修正的c-myc量为5.6倍，范围从4.9到5.6。 大脑的结果是误差的一倍。2. 2-Cf方法2.1. 2-Cf法的导出根据内标准RNA，可以校正加上RNA的量的差异。 2-CT法的数据分析的特征之一是，可以利用实时PCR实验的一部分数据来完成这个校正。 在其他方法不能量化初始RNA量的情况下，例如，在所获得的RNA量非常有限或者需要处理高吞吐量样本时，该方法的优点特别显着。 当然，除了PCR实验以外的方法也可以进行该校正。 一种最常用的方法是使用紫外吸收来确定在cDNA合成中使用的RNA量，并将通过同一RNA的反转产生的cDNA用于PCR定量反应。 这种外标法校准的应用实例之一是研究某些实验处理是否影响内标基因的表达。 在这里，目标基因和内标是一体的。 在该例子中，式2不能被式3整除，式5 如下.整理：其中一个样品X0、q除以参照品X0、cb :这里 CT=CT、q-CT、cb。 ct与前面的计算中使用的ct (从目标基因CT值中减去参照基因CT值后的值)进行区别。如1.1节所述，条件的优化良好，效率接近1时，内坐标相对于参照因子如下2.2. 2-Cf法的应用2-CT法的应用之一是确定实验处理对某候选内标准基因的影响。 为了显示这个过程，进行了血清饥饿/诱导实验(7)。 血清饥饿/诱导是研究某一mRNA分解的常用方法8。 但是血清可能影响一些基因的表达，包括标准看家基因的表达。24h血清饥饿培养后，在NIH 3T3细胞中加入15%血清诱导基因表达。 从细胞中提取Poly(A) RNA，将其逆转录成cDNA。 用SYBR Green实时定量PCR测定了GAPDH、2 -微全球cdna的量。 GAPDH和2 -microglobulin各自的相对量用2-CT式求出。 细胞处理对GAPDH的基因表达有明显的影响，但对2 -微球蛋白没有多大影响。 因此，2 -微球蛋白适合血清刺激定量实验的内标，而不适合GAPDH。 这个例子显示了在只研究一个基因的情况下，如何用2-CT的方法分析基因的相对表达数据。3 .实时PCR数据的统计学分析实时PCR最终分析了阈值循环或CT。CT值由PCR信号的对数值和周期数决定。 CT值是一个指数型非线性的概念。 因此，在任何统计分析中，请勿用原始CT值表示结果。 如上所述，通常连同内部坐标和参考样本来计算PCR相对量，并且很少用CT值来直接表示，除了想验证重复样本之间的差异。 为了展示这一点，利用SYBR Green在实时PCR中检测到了同一cDNA的96次重复反应。 将所有的反应成分混合在同一管中后，分成96根管，进行实时PCR分析，得到了每个样品的C T值。 为了比较样本之间的变化，计算了96个样本的平均SD，但根据原始CT值计算，平均SD为20.000.193，CV为0.971%。 但是，如果将原来的C