生物素、亲和素标记技术

.,生物素、亲和素标记技术,广州医学院第一附属医院检验科廖伟娇,.,一、生物素及其理化性质1概念2分子式结构特点溶解特性等电点其它特性,.,1概念：生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。分子式：C10H16O3N2S分子量：244.31,.,结构特点：咪唑酮环/四氢噻吩环结合亲和素侧链末端羧基结合蛋白质溶解特性：难溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF),.,等电点：PH=3.5其它特性：羧基需经活化修饰才能结合蛋白质（羧基活化的生物素，称为活化生物素，也叫生物素衍生物）,.,生物素衍生物的种类及特性：1生物素羟丁酰亚胺酯(BNHS)：DMF制备：生物素+N-羟基琥珀酰亚胺二环己基碳二亚胺标记特点：BNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基结合达到标记的目的适用于：标记Ab、酶、中性或偏碱性Ag、DNA,.,长臂活化生物素(BCNHS)：DMF+6-氨基己酸制备：生物素+N-羟基琥珀酰亚胺二环己基碳二亚胺(在BNHS的B与羧基之间插入2分子的6-氨基己酸）标记特点:(同BNHS)BCNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基结合达到标记的目的适用：(同BNHS)标记Ab、酶、中性或偏碱性的Ag、DNA,.,3生物素酰肼(BHZ)：制备：生物素+水合肼标记特点：BHZ与蛋白质中的醛基结合而标记适用：标记偏酸性的蛋白质、酶、DNA,.,三、亲和素及其理化性质1概念2分子式结构特点溶解特性等电点其它特性,.,1概念：亲和素(avidin)：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化合物的碱性糖蛋白。链霉亲和素：是从链球菌属的菌培养液中提取的一种蛋白质分子量：A:6.7KDSA:66.5KD,.,3结构特点：每分子由四个亚基组成溶解特性：溶于水，C=5mg/ml等电点：A:PH=10.5SA:PH=6.0比活性：A12u/mgPSA14u/mgP,.,四、亲和素的活性及其测定1亲和素的活性：是表示亲和素结合生物素的能力，即：ugB/mgA或ugB/mgSA。,.,活性测定：羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法：A(SA)+HABA（红色）BA-B（出现黄色时B的量）分光光度法：,.,五、生物素标记物及亲和素标记物的制备：1生物素标记物的制备：B+Ab/Ag/E交联剂B-Ab/Ag/E亲和素标记物的制备：A/SA+Ab/Ag/E交联剂A/SA-Ab/Ag/E,.,六、技术类型：可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹心法、间接法、竞争法等，在次基础上引入A-B系统。BAB法：Ag+BAbAg-AbBAAg-AbB-ABEAg-AbB-A-BE特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E,返回,.,BA法：Ag+BAbAg-AbBAEAg-AbB-A-BE特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省却了加B-E的步骤,.,ABC法：A+BEA-BE-ABCAg+BAbAg-AbBABCAg-AbB-ABC特点：将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC,.,返回,+A,+A,.,Ag-Ab1-Ab2-B+A-EAg-Ab1-Ab