实验一凝胶过滤层析分离蛋白质VIP

.,生物化学与分子生物学实验,带教:张学礼、戴薇薇龚张斌、黎志萍,.,实验课要求试剂用后及时归位及时记录实验结果按时完成实验报告离开时做好清洁工作,.,实验报告的书写,标题日期一、实验目的二、实验原理三、操作步骤四、实验结果五、分析讨论,.,实验基本操作,一、玻璃仪器的洗涤二、吸量管及微量取样器的使用三、溶液的混匀四、离心机的使用,.,实验一凝胶过滤层析法分离蛋白质,1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理；2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。,一、实验目的,.,二、实验原理,1.常用生化实验技术,分光光度技术电泳技术离心技术层析技术,.,2.层析技术（色谱技术）,是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等）建立起来的技术。,.,（1）层析系统的基本组成,固定相+流动相,固体物质/固定于固体物质的成分,可以流动的物质：如水和各种溶媒,.,待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相,由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同,与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时受到的阻滞作用小，移动速度快,.,（2）层析法的分类,按两相所处状态分类,.,按层析原理分类,.,按操作形式不同分类,.,（3）层析技术的优点,分离效率高分析速度快具有极高的灵敏度应用范围广,适用：杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析,.,3.凝胶过滤层析法（gelfiltrationchromatography）,（1）原理：根据分子大小的差别进行分离。每个凝胶颗粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部，大分子物质被排阻在外。,又名分子筛过滤，排阻层析,.,.,（2）凝胶的特点,属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。,交联葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶,.,（3）凝胶的选择,葡聚糖凝胶(商品名:Sephadex，Dextran)型号:G-10G-200,多孔网孔结构,数字愈小,交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小,.,SephadexG-50：对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为:150030000SephadexG-200：对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为:500080000,例：,.,B.琼脂糖凝胶(商品名:Sepharose,Bio-gelA)对实验条件要求高(温度,pH)404.5-9.0工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限,用于大分子物质的分离,.,C.聚丙烯酰胺凝胶商品名:BiogelP（生物胶P）,.,三、实验操作,1.柱的选择直径：15cm一般长度：直径=10：120：1本实验玻柱：直径0.81.5cm长度1720cm,.,2.凝胶选择、制备,血红蛋白溶菌酶分离（64500）（11400）选择SephadexG-50,SephadexG-50：对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为:150030000,.,制备：将干胶颗粒悬浮于510倍的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去,.,3.凝胶装柱,柱固定于架子上，垂直放置，关住出口自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50开始下沉，至12cm时，打开出口凝胶逐层上升，至顶部2-3cm时，关闭出口,.,注意点：,垂直放置防止气泡产生防止柱的分层,.,4.平衡,放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实）,注意：,防止床面干涸，可适当补充蒸馏水,.,5.加样,加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露出床面时，立即关闭出口（将干未干）用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出,立即加入12倍于样品体积的蒸馏水,.,6.洗脱,当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸馏水，进行洗脱，直到两带分开检查Hb在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后，用试管分步收集洗脱液10d/管，每管加NaOH2d，CuSO42d检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+