MALDI-TOF蛋白鉴定问题集.ppt

MALDI-TOF/TOF蛋白鉴定问题集,适用样品,双向电泳凝胶点经过纯化的蛋白溶液或单一的SDS-PAGE条带考染或质谱兼容银染凝胶样品均可以检测样品最好使用进口ep管盛放寄送方式：如果胶内样品或冻干样品，可以常温快递或加入冰袋后快递，如果是溶液样品，可加入冰袋快递，最好加入干冰后快递。,所用仪器,检测仪器型号：4800PlusMALDITOF/TOFTMAnalyzer仪器公司：ABI（FosterCity）检测方式：正离子，反射检测基质：HCCA（5mg/ml）,仪器原理示意图,实验方法及步骤（分成两页）,实验方法：胶内酶解（Trypsin,20个小时）-抽提酶解肽段-ZipTip脱盐-MALDI-TOF/MALDI-TOF/TOF质谱-软件分析数据-鉴定蛋白质实验步骤：1）胶内酶解及Ziptip脱盐：每个胶粒切碎后放入Eppendorf管中，每管加入200-400L100mmol/LNH4HCO3/30%ACN脱色（若为银染，取30-50L30mmol/LK3Fe(CN)6：100mmol/LNa2S2O3=11(体积比)脱色），冻干后，加入5L2.5-10ng/L测序级Trypsin(Promega)溶液（酶与被分析蛋白质质量比一般为120-1100），37反应过夜，20小时左右；吸出酶解液，转移至新EP管中，原管加入100L60%ACN/0.1%TFA,超声15分钟，合并前次溶液，冻干；若有盐，则用Ziptip（millipore）进行脱盐。2）质谱分析：样品与5mg/mlHCCA基质1:1混合后，用4800串联飞行时间质谱仪4800PlusMALDITOF/TOFTMAnalyzer)(AppliedBiosystems，USA)进行质谱分析，激光源为355nm波长的Nd:YAG激光器，加速电压为2kV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据，PMF质量扫描范围为8004000Da，选择信噪比大于50的母离子进行二级质谱(MS/MS)分析，每个样品点上选择8个母离子，二级MS/MS激光激发2500次，碰撞能量2kV,CID关闭。,数据库检索参数,3）数据库检索：Database:NCBI（不同项目可能会有区别）Taxonomy:Mycoplasma（7442）下载时间：2010-6-12（不同项目是不同的）Typeofsearch:PeptideMassFingerprint(MS/MSIonSearch)Enzyme:TrypsinFixedmodifications:Carbamidomethyl(C)Massvalues:MonoisotopicProteinMass:UnrestrictedPeptideMassTolerance:100ppmFragmentMassTolerance:0.4DaPeptideChargeState:1+MaxMissedCleavages:1,结果报告形式,检测到蛋白列表的pdf及excel格式（其中详细包括蛋白名称，登录号，物种，理论分子量等电点，蛋白得分，蛋白可信度，检测到肽段数量和序列等信息）Targetinformation（靶点和样品名称对应关系，以及该样品是否检测成功）Ms和msms图谱的raw文件（通常每个样品有1张ms图谱和8张msms图谱），及图谱提取的相关软件,样品靶位,蛋白质排名,蛋白质名称,物种,登录号,分子量,等电点,检测到的肽段数,蛋白质得分,蛋白质可信度,总离子得分,肽段信息,理论分子量,实际分子量,分子量误差,起始氨基酸位置,肽段序列,结束氨基酸位置,肽段离子得分,肽段可信度,肽段固定修饰,总离子可信度,结果说明,问题,鉴定成功标准：proteinscorec.i.%大于95。蛋白得分则因蛋白长度和序列不同有一些区别，大约在50-55分以上。导致鉴定不成功的因素：1.蛋白量少，如测试的双向电泳凝胶点颜色较淡，点较少2.数据库不完整，如猕猴桃来源样品，这种情况下通常会将数据库上推2-3个级别，查询更大的数据库3.样品中所含蛋白复杂度较高，如某些SDS-PAGE条带肉眼所见为一个条带，但却是由若干种蛋白构成实际与理论分子量等电点不符合：这通常是由于实际动植物体内，蛋白都是有修饰或者有剪切发生，这时，分子量和等电点就会发生与理论计算不符合的情况双向凝胶电泳上一个点质谱鉴定出多种蛋白双向电泳虽然有较高的分辨率，但是有时候还是会出现两个或多个蛋白有相同或相近的分子量和等电点，这时一个凝胶点就包括了多种蛋白，因而鉴定结果也会出现多