DNA甲基化检测方法演示教学.ppt

DNA甲基化检测方法,DNA甲基化检测方法总览,主要检测途径,基于重亚硫酸盐转化的方法(金标准)不基于重亚硫酸盐转化的方法,基于重亚硫酸盐转化的方法,质谱分析水解核苷酸质谱分析,基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理1,基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理2,应用一:直接测序法（Directsequencing),用于甲基化分析的样本常常是混合样本，不适合直接直接进行sanger测序分析,直接测序法,图6PMVK基因扩增产物反向测序结果,图7TRIB3基因扩增产物正向测序结果,应用二：重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序(Bisulfite-sequencePCR，BSP),注：A：癌组织；B：癌旁组织；：未甲基化；：甲基化,43A,43B,(369bp),43B,BSP克隆测序结果,BSP克隆测序甲基化率三维图形,优点:能准确的检测出每个DNA分子单倍体型的甲基化状态，同时能分析不同CpG位点之间的甲基化状态的联系。缺点：需要对PCR产物克隆，操作繁琐，费时费力，克隆子的数目影响结果的准确性。测序重复性差。,应用三：甲基化特异性PCR(methylafion-specificPCR，MS-PCR),UMUMUMladder,100,150,200,250,MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化,图MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片,甲基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化。,MSP扩增产物凝胶电泳图,研究结果,注：M表示甲基化，U表示未甲基化B1-B6为高脂血症组六例标本，D1-D5为正常对照组五例标本；H2O为阴性对照；m为50bpMarker。,SREBP-1基因启动子区CpG岛甲基化状态,甲基化特异性PCR,优点：操作简便；敏感性高；Nested-MSP提高灵敏度，便于分析微量检材缺点：引物设计要求高；只能作定性研究；存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性；只能了解部分位点的甲基化状态。,MethyLight,对MSP的产物用Taqman探针进行qPCR，从而实现甲基化的定量分析。,优点：增加了重亚硫酸盐转化和DNA复性的质控对照避免了电泳、酶切等操作缺点：PCRbias,应用四：结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA),结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法,基于限制性内切酶的工具酶,甲基化特异性的限制性内切酶(MDRE)：可以识别甲基化的胞嘧啶,甲基化敏感性的限制性内切酶(MSRE)：可以识别甲基化的胞嘧啶,基于限制性内切酶的甲基化分析方法,MSRE-PCR原理,图1-1MSRE-PCR原理图注：左图DNA无甲基化,DNA被切断,无法得到PCR产物;右图DNA有甲基化,DNA保持完整,可以获得PCR产物.,应用举例二：,采用甲基化敏感性限制性内切酶技术结合PCR的方法（MSRE-PCR）筛选在肝癌与癌旁组织中有甲基化差异的基因。,注：M：Marker；E：加酶体系；A：癌组织；B：癌旁组织；空：水空白,酶识别位点内含有一个及以上CpG位点,应用条件：,结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法,优点：方法相对简单；可进行甲基化水平的定量研究；需要样本量少。,缺点：由于CG仅限于内切酶识别序列中，因此非识别序列的CG将被忽略；只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义；存在酶消化不完全引起的假阳性的问题；,结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法,应用五：RestrictionDigestionandReal-TimePCR(qAMP),基本步骤,举例：Theevalutionofdifferentiallymethylatedregion(MDR)ofimprintedgeneU2af1-rs1,intestisandliverofmouse,PrimeraredesignedtoflankNotl(N),Hhal(Hh),andMcrBc(M)RestrictionsitesintheDMRregion.,LiverandtestisgenomicDNAtemplatesarePCRamplicatedfollowingdigestionwithnoenzyme(sham),Notl,Hhal(Hh)orMcrBc.AmplicationusingasecondprimerpairthathasbeendesignedtoasequencedevoidOfrestrictionsitesdemonstratesthatthetemplatesareofequalconcentration.,ThedifferenceintheCtvalueofanenzyme-digestedtemplaterelativetothesham-digestedtemplatedeterminatesthelevelsofDNAmethylationineachtissue.,MSRE,MDRE,应用六：基于亲和纯化的甲基化分析方法,基于亲和纯化的甲基化分析方法,应用七：ChIP-Seq技术,ChIP-Seq,应用八：芯片技术在甲基化检测中的应用,启动子区甲基化芯片技术,基因芯片杂交信号图,应用九、质谱技术（MassSpectromericAnalysisofCytosineMethylationbyBase-SpecificCleavageandPrimerExtensionMethods）,如图所示切下的每个片段含有一个或两个CpG位点，在质谱图上甲基化片段和未甲基化片段大小相差16Da或32Da,Base-SpecificCleavage,PrimerExtensionMethods,如图所示，用ddC和ddT终止延伸后，在质谱图上显示出甲基化组（ddC）和未甲基化组(ddT)的质谱峰,二者相差16Da。,Base-SpecificCleavage检测的是一个酶切后片段的甲基化状态，用于在长片段DNA序列（如基因启动子区域）中筛选甲基化位点并确定每个甲基化位点的甲基化程度，而在基因的甲基化谱确定后可以用PrimerExtensionMethods精确的对每个CpG位点的甲基化程度进行定量检测，PrimerExtensionMethods最多可以实现25个位点同时检测。,质谱法检测的优势：,灵敏度准确性高。操作较简便。局限性：DNA样本要求纯度较高，提取过程中的小离子，未消化完全的蛋白，RNA对结果有干扰作用。需用质谱仪。,应用十、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸法（methylation-sensitivesinglenucleotideprimerextension(Ms-SNuPE)）,扩增,基因组DNA样本,重亚硫酸盐转化,ExoSAP消化,PCR,引物延伸,加入SNP引物和SNaPshotMix,SNP引物延伸(加入ddT或ddC),SAP处理,分析,310/3100样本准备加入GS120LIZ内标,ABI310/3100电泳选用E5和POP4胶,数据分析（GeneScan）,样本分型（Genotyper或GeneMapperID）,步骤,1,2,3,4,5,6,这是一个多重SNaPshot的检测结果，总共检测了6个CpG位点，阴影峰代表甲基化的C，空白峰代表未甲基化C。位点1、2和4显示大约50%的甲基化率，而位点3、5和6显示0的甲基化率。,应用十一：高分辨熔解曲线分析MS-HRM,HRM技术：用于筛选大量样本，获得感兴趣的CpG位点鉴定感兴趣的CpG岛。,HRM技术原理,HRM技术原理,HRM特点,高灵敏性：可检测低达0.1%甲基化程度。高通量：1次可同时检测不超过384样本，适用于大样本多位点甲基化扫描。高重复性：重复性100%。使用范围广：不受碱基位点局限。操作简便：只需设计特异引物，无须序列特异性探针，无需测序。标本范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。,缺点：检测序列长度不应超过100bp；只能进行半定量检测,应用十二：焦磷酸测序法,焦磷酸测序法（Pyrosequencing）,焦磷酸测序法（Pyrosequencing）,焦磷酸测序,焦磷酸测序,焦磷酸测序,焦磷酸测序的优势：灵敏度高，可测到邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至包括测序的引物区域。除常规的检测位点变化情况外，还可准确计算频率变化。对于检测位点要求低，可检测未知序列信息，覆盖到人类基因组的所有CpG位点；对于样品要求低，适用于新鲜、冷冻和FFPE样本。,应用十三：QuantificationofMethylatedDNAbyHeavyMethylDuplexPCR,PrincipleofHeavyMethyl(A)WhentheDNAismethylated,theblockeroligonucleotides(solidblack)donotbind,leavingtheprimerbindingsiteaccessiblefortheprimers(grayarrows)tobindandamplifythetarget.Theamplicationisdetectedwithamethylationspecificoligonucleotideprobesolidblack,labeledwithfuorescentdye(F)andquencher(Q)ina5-exonucleaseassay,usedhereasanexampleforareal-timedetectionmethod.(B)WhentheDNAisunmethylated,theblockeroligonucleotidesbind,blockingtheaccessoftheprimerstotheirbindingsites.NoPCRproductisgenerated.,samplethroughputversusgenomecoverage.AplotofsamplethroughputagainstgenomecoverageforvariousDNAmethylationtechniques.Throughputisdeterminedbythenumberofsamplesthatcanbeanalysedperexperiment,basedonlargeeukaryoticgenomes.CoverageisdeterminedbythenumberofCpGsinthegenomethatcanbeanalysedperexperiment.,不同甲基化检测方法的检测通量,1.筛选Differentiallymethylatedregion；,课题流程：,2.对筛选出的DMR进行测序，验证是否具有甲基化差异性，同时筛选出随龄变化相关性强的CpG位点；,3.检测每个样本CpG位点的甲基化率，做回归分析。,做回归分析需要的样本量很大，每个样本需要检测多个CpG位点。基于克隆的Sanger测序需要多个克隆子，操作繁琐，重复性差，成本会很高；焦磷酸测序需要对多个片段进行测