SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳详解.ppt

聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，1。什么是战略部署储存？十二烷基硫酸钠是一种阴离子洗涤剂。它以单体和胶束的混合物形式存在于水溶液中。SDS的作用是破坏蛋白质分子和其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性并改变原始构象，确保蛋白质分子和SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。SDS-PAGE的基本原理(1)在蛋白质分子的解聚样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基的分子量，而电荷因子可以忽略。1、SDS阴离子去污剂变性增溶剂破坏分子内和分子间氢键分子，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；2、强还原剂巯基乙醇(-巯基乙醇)二硫苏糖醇(DTT)破坏半胱氨酸残基之间的二硫键。十二烷基硫酸钠和还原剂的作用：(1)分子解聚或形成多肽键；(2)氨基酸侧链与十二烷基硫酸钠充分结合形成带负电荷的蛋白质-十二烷基硫酸钠胶束。(3)蛋白质-SDS胶束携带的负电荷大大超过了蛋白质分子的原始电荷，消除了不同分子之间的原始电荷差异。蛋白质-十二烷基硫酸钠胶束的特征(1)是长椭圆形杆状(2)短轴对于不同的蛋白质亚基-十二烷基硫酸钠胶束基本相同。(3)长轴的长度与亚单位的分子量成正比。SDS-PAGE体系中胶束的电泳迁移率不再受蛋白质原始电荷的影响，而是主要取决于椭圆杆的长轴长度，即蛋白质或亚基的分子量。当蛋白质的分子量在15 kD和200 kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数成线性关系。3.影响十二烷基硫酸钠电泳的关键因素(1)溶液中十二烷基硫酸钠单体浓度(1摩尔/升)大多数蛋白质与十二烷基硫酸钠结合的重量比为1: 1.4 (2)十二烷基硫酸钠单体在溶液中的平衡浓度较高，样品缓冲液的离子强度较低(不是0.26)。(3)二硫键是否被完全还原当二硫键被完全还原时，蛋白质分子可以解聚，并且SDS可以定量地结合到亚基上，从而给出相对迁移率和分子量对数之间的线性关系。(2)缓冲体系的选择通常，在待分析蛋白质的稳定的酸碱度范围内，可以使用任何不与十二烷基硫酸钠相互作用的缓冲液，但是缓冲液的选择对蛋白质分离和电泳的速度非常关键。电泳缓冲液的类型有：1、磷酸盐缓冲液2、三乙酸钠缓冲液系统3、咪唑缓冲液系统：电导率低于磷酸盐缓冲液系统，电泳速度是后者的两倍。4.尿素系统：适用于分子量低于15KD的蛋白质样品。5.三甘氨酸系统：缓冲液使用最多。三硼酸盐缓冲溶液：糖蛋白分子量的测定，(3)凝胶浓度的选择，因为SDS电泳分离不取决于蛋白质的电荷密度，而只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小，凝胶浓度的选择将直接影响分辨率。对于不同分子量范围的蛋白质，应选择不同的凝胶浓度。(4)分子量测定1。相对迁移率(Rf)Rf通过将每个带的迁移距离除以溴酚蓝锋的迁移距离获得。测量位置应该在蛋白质带的中心。蛋白质带迁移距离Rf=愚人节354335433543354溴酚蓝迁移距离，凝胶长度Rf=愚人节354335433543354干燥后凝胶长度溴酚蓝迁移距离，2。该图以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，以射频为横坐标。3.通过测量未知蛋白质的Rf值，可以在标准曲线上读出未知蛋白质的分子量。3.洗涤剂非离子洗涤剂的选择：LubroW；Brij35，TweenTriton阳离子洗涤剂：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)十六烷基吡啶鎓(CPC)阴离子洗涤剂：丁羟胆酸盐，四种，方法1，分类(1)根据不同的处理方法进行样品还原SDS电泳非还原SDS电泳与烷基化还原SDS电泳，(2)根据缓冲体系和凝胶孔径的不同进行连续电泳不连续电泳(3)根据电泳形式进行圆盘电泳垂直电泳平板电泳水平电泳，(2)操作(1)制备分离凝胶(2)制备叠层凝胶(堆积凝胶) 分离凝胶聚合后，在蛋白质溶液中加入过量的十二烷基硫酸钠会引起如下反应：蛋白质本身的电荷被屏蔽，氢键被破坏，疏水相互作用被取消，多肽被展开(二级结构被破坏)，形成椭球形； (1)还原SDS处理当加入还原剂DTT或-二巯基乙醇时，蛋白质完全展开，仅根据分子量进行分离。(2)烷基化还原十二烷基硫酸钠能长时间、牢固地保护巯基，并能获得窄的电泳带。(3)当使用非还原性十二烷基硫酸钠处理许多样品时，如生理液体、血清或尿素，一般只需将1%的十二烷基硫酸钠在100煮沸3分钟，无需添加还原剂。此时，二硫键不能断裂，蛋白质也不能完全展开。(4)电泳(5)固定化，(6)染色考马斯比林蓝(1) r-250三苯基甲烷，红色和蓝色，每个分子含有两个SO3H基团，是酸性的，并与蛋白质的碱性基团如氨基黑结合。(2) G-250二甲基花为亮蓝色和蓝绿色。银染色的机理是将蛋白质带上的硝酸银(银离子)还原成金属银，从而在蛋白质带上沉积银颗粒。(7)摄影，凝胶干燥(8)定量测定，3)电泳过程中的异常现象(1)“微笑”现象指示锋呈两边朝上的曲线，表明凝胶冷却不均匀，中部冷却不良。(2)“皱眉”现象是由于垂直电泳槽装置不当造成的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“夹层”底部有气泡或隔板附近凝胶聚合不完全时。(3)“拖尾”现象是由于样品溶解不良造成的。(4)“纹理”现象是由样品中的不溶性颗粒引起的。(5)电极放置不平行或样品施加位置偏移引起的偏转现象，(6)带宽太宽、样品施加量太多或样品施加孔泄漏，分子质量超过或等于分子质量的分子质量(symbolm)IsExpressedIdalTons(Da)，OnedaltonIsDefinedDas 1/12碳12。mostMacroleCulesarelargeenoughtousetheklodalton(kDa)到describemolecularmass。molecularwightisnotthesameamsmolecularmass . itisalonknownasrelativemolecularmass(symbolMr，where risasubscript). molecularwightisdefinedashrationofmassomacromeoleto1/12 themassofacarbon 12汤姆.itis adidimensionlesquantity . when the trainturegivesamasindoarkdaitreferstomolecularmass . itis imprectortoexpressmolecularwighting(r relativemolecularmass)in Dal