GST pull-down实验技术ppt课件.ppt

GSTpull-down实验技术，演示者：分段支纲，1，GSTpull-down原理GSTpull-down实验过程，GSTpull-down原理：GSTpulldown在体外与蛋白质交互原则：已知蛋白质利用DNA重组技术与gluthionestransferase(GST)融合，融合蛋白通过GST与载体固定的Glutathione(GTH)友好结合。因此，与融合蛋白相互作用的蛋白质在通过色谱柱时或与这种固体复合物混合时可以吸附和分离。GST拉-拉-拉-拉原理：基本原则：假设A蛋白和b蛋白可以相互作用，培养精制融合GST标签中的A蛋白和精制b蛋白，与GST特定结合的Sephrose4Bbeads，充分清洗未结合的蛋白质，对SDS-PAGE电泳进行BDS-PAGE电泳GST对照组总是只有一个波段。GSTpull-down图，GSTpull-down过程确定两种已知蛋白质的相互作用筛选与已知蛋白质相互作用的未知蛋白，GST-A融合蛋白的制备b蛋白的制备体外蛋白的结合Westernblot检测，1.1GST-A融合蛋白的表达1.2GST-A融合蛋白GST-A融合蛋白的制备，1.1GST-A融合蛋白的表达，1，冷冻保存菌株激活GST和GST-A: 1:50比率表达蛋白的冷冻保存菌液，放入5ml lb (amp)，37，200rpm的培养中过夜；2，300 mllb (amp ) 220rpm，30 至OD600=0.4-0.6以13336100的比例通宵培养的培养物；3、目标蛋白(IPTG 0.5mm，20，200rpm培养1016小时)的预先实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达；4、适当时间诱导后，4，5000rpm/min离心10分钟后报废(必要时可保存在-80)；1.1GST-A融合蛋白表达，5，重沉淀：重悬浮和PMSF由10ml细菌沉淀1mlPBS添加；添加。6、冰上超声沉淀悬浮液：5S间隔5S 悬浮透明(一般可溶性蛋白：10ml细菌沉淀用1mlPBS中悬浮超声6 9分钟透明)；7，12000 rpm/min，在4 下离心10分钟，升华为具有1 mmol/L DTT全浓度的新离心管。1.2GST-A融合蛋白的纯化，1，在新鲜制造的分解物中加入适量的50%谷氨酰胺sepharose 4b，在4 缓慢摇晃，反应30 60分钟；3000rpm/min，4离心3min被抛弃。Sepharose结合GST-A融合蛋白。3、将预冷200微升PBS添加到管内(沿墙添加，注意不要干扰biz和蛋白质的连接，不要激烈)，轻轻摇动biz，洗一次Sepharose，3000rpm/min，4 下3min离心，废弃；第4，3阶段重复3次(最后用小枪吸珠子表面液体，吸珠子，但不吸)，与GST-A融合蛋白结合的Sepharose可以得到；1.2GST-A融合蛋白的纯化，5，用于检测时，在Sepharose中加入1520微升1蛋白电泳样品缓冲液，在沸水中煮5 10分钟。在6，12000 rpm/min离心5min上执行SDS-PAGE和WB测试。B蛋白来源：1.1(His)-B融合蛋白的原核表达和纯化1.2(HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达，2 .B蛋白的制备，1，激活冷冻保存菌株His和His-B:表达蛋白的冷冻保存液按1333650比5ml lb (amp)，37，200rpm培养过夜；2，300 mllb (amp ) 220rpm，30 至OD600=0.4-0.6以13336100的比例通宵培养的培养物；3、目标蛋白(IPTG 0.5mm，28，200rpm培养1016小时)的预先实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达；4、适当时间诱导后，4，5000rpm/min离心10分钟后报废(必要时可保存在-80)；1.1.1(His)-B融合蛋白的原核表达，5，重悬沉淀：重悬PMSF，由10ml细菌沉淀1mlPBS添加；6、冰上超声沉淀悬浮液：5S间隔5S 悬浮透明(一般可溶性蛋白：10ml细菌沉淀用1mlPBS中悬浮超声6 9分钟透明)；7，12000 rpm/min，在4 下离心10分钟，将相变材料输送到新的离心管，DTT总浓度1mmol/L，1.1.1(His)-B融合蛋白的原核表达，1.1.2(His)-B融合蛋白的纯化，1，在新鲜制造的分解物中添加适量的Ni-NTA珠，在4 慢慢摇晃，反应30 60分钟；3000rpm/min，4离心5min，舍去。Ni-NTA珠结合His-B融合蛋白。3、在管内预冷的200微升wash缓冲器(沿墙添加，不切断biz和蛋白质的连接，轻轻摇动biz，冲洗一次biz，在3000rpm/min，4 离心扔掉3min重复步骤4，3三次(最后用小枪吸珠子表面液体，吸珠子，但不吸)，即结合了他的融合蛋白的Ni-NTA；得到；得到。1.1.2(His)-B融合蛋白的纯化，5，添加适量的体积ElutionBuffer，博客和洗脱蛋白不摇晃。3000rpm/min，4离心5min，清水，His-B融合蛋白，6，如果用于测试，取10微升样品，加入10微升1蛋白电泳相缓冲液，在沸水中煮沸5 10分钟；在712000 rpm/min离心5min上执行SDS-PAGE和WB测试。1，将编码b蛋白的ORF克隆到HA/Myc/Flag等编码标签蛋白的真核表达载体；2、转染后3648h，去除细胞，用预冷PBS清洗2次；3、添加适量体积1RIPA(含PMSF)，在冰上或4 将细胞分解10 30分钟。4，12000 rpm/min，4离心5min至-80 储存，或执行以下实验：1.2(HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达，3 .结合体外蛋白，1，将Sepharose4B与GST-A融合蛋白相结合，悬浮在适当的体积缓冲区，将含b蛋白溶液(原核表达或真核表达产品)2030微升，将Sepharose与GST蛋白相结合作为语音对照；2、在水平摇床中，4 摇晃4 8h。3000rpm/min，4 下3min离心；注意不要妨碍底部)；4、预冷200微升缓冲液加入Sepharose洗涤(沿墙添加，不要直接冲击Sepharose，然后轻轻摇晃，Sepharose沉重悬挂；3 .结合体外蛋白，5，3000 rpm/min，4 离心3min，上等化(