第三章-蛋白质的修饰和表达.ppt

1、第3章蛋白质的修饰和表达，第1节蛋白质修饰的化学途径第2节蛋白质改造的分子生物学途径第3节蛋白质的表达，2，第1节蛋白质的化学修饰，1，蛋白质侧链基的化学修饰2，蛋白质部位的特异性修饰3，蛋白质的聚乙二醇修饰4， 蛋白质的化学交联和化学偶联，3，1，蛋白质侧链基的化学修饰部位：蛋白质的侧链基，修饰机制：选择性的试剂或仿射色谱与侧链上的特定功能基发生化学反应，修饰类型：巯基、氨基、羧基、二磺巯基的修饰特征：亲核最容易反应的侧链基修饰试剂反应型烷基化试剂羧甲基化(碘酸、碘乙酰胺) N-乙基马来酰亚胺光吸收DTNB二硫化物键，有色的TNB， 5、(二，氨基的化学修饰)特征：亲和反应活性高的赖氨酸的-氨基修饰试剂反应类型TNBS黄色复合体(420nm )烷基化试剂(卤代乙酸、芳基卤素、芳香族磺酸)磷酸吡手性光吸收， 6、(3)羧基的化学修饰根据羧基在水溶液中的化学性质，蛋白质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法是有限的，生成物一般是酯类或酰胺类。 水溶性碳化二亚胺类的特定修饰羧基最宽，可以在比较温和的条件下进行，如7，(4)二硫化物键的化学修饰、修饰方法：还原修饰试剂：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 为了判断蛋白质分子中有无二硫化物键，使用非还原/还原双向SDS-PAGE电泳技术来判断链内二硫化物键还是链间二硫化物键。 处理后的蛋白质会自动氧化，再形成二硫化物键，所以有必要实施羧甲基处理，防止二硫化物键的再形成。8、化学修饰的影响条件、1、温和的反应条件是防止蛋白质分子改性所必需的条件2、pH值的变化：决定具有潜在反应能力的基团所在的可反应的离子状态和不可反应的离子状态3、温度：影响活性巯基的微环境4、有机溶剂：试剂是有机的9，2，蛋白质的部位特异性修饰，特征：试剂对被修饰基、修饰部位特异性类型的特征，用仿射色谱活性部位分离细胞表面受体，在不可逆仿射色谱活性部位鉴定与疾病有关的目标部位不可逆的蛋白质光反应基，10，3， 蛋白质的聚乙二醇修饰、PEG特征：亲水、无电荷结合机制：形成共价键屏障保护抗原，阻止免疫反应和酶水解修饰的方式：活化-OH (激烈条件)偶联基：氨基、巯基、羧基的优点：延长半衰期，毒性小酶解作用降低应用：门冬氨酸氨酶、腺苷脱氨酶PEG修饰脂质体包复阿奇霉素、11、4、蛋白质的化学交联和化学偶联、交联：含有两个功能基的化学试剂与蛋白质分子之间形成网状交联。 偶联：蛋白质分子与化学惰性的水不溶性载体偶联。蛋白质的化学交联，13，蛋白质的化学交联，14，蛋白质分子固定图像，15，16，第二节蛋白质的分子生物学改造，基因突变定点突变取向进化基因融合，17，限制酶，外来DNA，限制酶，退火， 重组质粒，转化，受体细胞，筛选，表达， 带重组体的细胞目的物、质粒、一、目的基因的获得、目的基因、二、重组、三、重组体转入受体细胞，四、筛选和鉴定接受重组体的细胞，五、外来基因在受体细胞内表达，18，(一)定点突变，定义： 再现性好的方法：重叠PCR技术，快速定点突变应用：降低纤维蛋白原活性剂血浆去除率，延长血浆半衰期，19，1，重叠拉伸PCR技术，20，通过重叠拉伸PCR的定点突变，21，2，快速定点突变，22，限制酶，外来DNA，限制酶重组质粒，转化，受体细胞，筛选，表达，质粒，目的基因，酶切断，蛋白基因， 新的变异质粒23，酶切断，、同时获得多个变异体，盒变异，24，(2)定向进化，范围：特定的蛋白质条件：大量变异体，适当的筛选系统，25，1 容易错误的PCR原理：改变正常PCR反应体系的一部分成分的数量和质量，立即导入错误的碱基创造序列多样性的DNA文库。 难点：适当的突变频率、DNA重组技术原理：目标基因酶切出随机DNA片段，以3末端片段为引物和模板，随机互补结合拉伸。 优点：突变率高，适用不同种类，方法：容易出错的PCR，DNA改造技术，26，2，筛选，方法：表型观察选择，高通量筛选(1) 噬菌体表面技术概念：外源蛋白和噬菌体涂层蛋白融合存在于噬菌体表面的技术特征：基因型和表型统一在同一病毒粒子内，27，噬菌体展示技术的基本原理，28，(2)核糖体展示技术原理：该技术稳定抗体蛋白质与它的编码序列物理连接。 抗体基因转录，产生许多mRNA分子，分别代表不同的抗体基因。 mRNA分子和细菌核糖体孵化，mRNA被翻译成蛋白质。 各复合体显示不同的抗体，通过含有目标抗原的仿射柱后，可结合的复合体不会被冲洗，该展示技术完全在体外完成，不需要克隆就能构建大规模的抗体库。29、二、基因融合、概念：不同的基因或基因片段的序列构成新的杂交基因，在适当的表达体系中表达后，获得由不同功能蛋白融合的新的多功能蛋白。 原则：删除第一蛋白基因终止密码子，连接具有终止密码子的第二蛋白或多肽基因，实现两个基因的融合表达，30、基因融合策略，1， 方法将融合基因通过适当的酶切部位直接切断为适当的信号肽后，将目标基因两端分别贴上不同亲和性标签的目标基因插入信号肽序列和插入序列之间，影响基因融合的因素：设计融合蛋白接头和构建融合蛋白的常用技术的选择3， 主要利用其生物学功能与受体结合的特异性，构建诱导药物的问题，31，第三节重组蛋白的表达，根据宿主细胞的差异，由：原核表达系：大肠菌真核表达系：酵母、昆虫、哺乳动物、克隆载体(cloningvector )插入的外来d 表达载体(expressionvector )将插入的外来DNA序列转录到多肽链上，将为能翻译而设计的载体称为表达载体。32、常见克隆载体：质粒载体、噬菌体粘粒载体等克隆载体(cloningvector )，33，一，目的蛋白质在大肠杆菌中的表达，大肠菌表达系统的优势： 1，大肠菌的背景特别是对基因表达调控的分子机制有深入的了解2 .在安全的基因工程实验系统中，具有不同种类的宿主菌株和不同种类的载体3 .许多克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中可以实现有效、高水平表达4 .大肠杆菌培养方便、操作简单、成本34、在大肠杆菌中表达系统的不足： 1、真核基因、结构上与原核基因之间存在很大差异。 2 .真核基因转录信号和原核差异。 细菌的RNA聚合酶无法识别真核启动子的外源基因可能包含具有大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3、真核基因mRNA的分子结构与细菌不同，影响真核基因mRNA的稳定性。 4、很多真核基因的蛋白质产物必须经过翻译后的加工修饰(正确折叠和组装)，但很多这种修饰作用不存在于细菌细胞中5 .细菌的蛋白质酶可以识别和分解外来真核基因表达的蛋白质分子。、35、(1)表达载体的构建(组成)、1、复制起点2、选择性基因3、启动子4、核糖体结合位点5、多克隆位点6、转录终止序列、r :序列的调节； p :启动子SD:SD序列TT :转录终止序列，36，Lac启动子(乳糖启动子) Trp启动子(色氨酸启动子) Tac启动子(乳糖和色氨酸杂合启动子) PL和PR启动子T7启动子，1 .启动子是开始外源基因表达的必要因素，被RNA聚合酶所识别：目前原核表达载体中常用的启动子有以下几种，37 2.SD序列提供的核糖体结合部位mRNA在细菌中的翻译是核糖SD序列(Shine-Dalgarnosequence )位于转录开始部位的上游813bp，是一部富含嘌呤的短篇电影，可以与核糖体30S亚基中16srrna3 端的部分序列互补地结合。 SD序列作为核糖体结合部位，保证了翻译起始复合体的形成。 38，3 .转录终止序列有助于外来基因的有效表达，尽管载体没有转录终止序列，也能表达几种外来蛋白，但表达效果通常不理想。 因此，很多原核表达载体都具有转录终止序列。 转印结束顺序长度不同，短的只有数十bp，长的达到数百bp。 转录终止序列有助于将克隆的外来基因重点转录到RNA聚合酶上，控制转录的RNA长度，提高RNA的稳定性。 位于启动子上游的转录终止序列可以阻止其他启动子阅读，降低背景的多克隆部位下游的转录终止序列可以防止外源基因的表达阻碍载体的稳定性。39、利用CAT基因分离和活性测定功能启动子，构建无启动子的CAT质粒载体、EcoliDNA、Ecoli基因库，构建细胞分裂物、14C标记氯霉素的乙酰coa、薄层色谱放射自表达40、载体中-半乳糖苷酶n端编码序列，细菌染色体DNA中-半乳糖苷酶c端编码序列，-互补(蓝-白筛选)，41、常用大肠菌表达载体1.Lac启动子的表达载体2.Trp启动子的表达载体Trp启动子的表达载体，组成包括： 1、大肠杆菌染色体DNA的5.4kbHind片段、Trp启动子、操纵单元、前导序列、弱体、trpE基因、trpD基因的部分序列。 2 .将该片段克隆到pBR322质粒的hind部位，构建ptrpED3表达载体(含两个hind部位)。3、切断消化hind部分酶，用核酸外接酶和S1核酸酶处理靠近EcoR1部位的hind部位，新的质粒载体ptrpED5-1.43，(2)用大肠杆菌影响外源基因表达的因素，1、启动子结构影响表达效率的基因显示低限制的基础转录水平，在表达毒性蛋白质或损害宿主细胞生长的蛋白质时，使用高度抑制型启动子是极其重要的条件。 诱导型可以通过简单的方法使用廉价的衍生物来诱导。 44，2，影响转录终止区外来基因表达效率的3，mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响4，密码子偏好性，45，5，表达定位根据外来蛋白在细胞内外的位置，是细胞内细胞质膜、细胞质外膜、细胞外培养基，46 1 .形成封入体的蛋白质， 由于易受细胞内酶的分解作用蛋白的保护，不伤害宿主细胞2、蛋白质产量高的二硫键的切断及翻译修饰作用的丧失，使外来片段编码的蛋白质在大肠菌中过度表达。 3、表达的质粒载体的构建比较简单。 表达的外源蛋白质定位于细胞内的优点： 47，1，封入体a蛋白质折叠，再折叠的蛋白质其生物学活性b蛋白质最终产量低，c蛋白质生产成本较高2，被还原的环境形成二硫化物键(硫氧还原蛋白质) 谷氨酸还原蛋白质系) 3，n末端存在蛋氨酸，因此影响蛋白质真实性4，蛋白质酶分解5，蛋白质种类多，因此精制复杂，表达的外来蛋白质局部存在于细胞内的缺点：48，细胞外周质表达，周质：大肠菌的特征：在周质中表达的蛋白质为了从细胞质通过细胞质内膜进入周质，需要信号肽序列。 49、优点：1.周质中蛋白质的种类少，目的蛋白质的纯化比较简单2 .蛋白质的酶分解程度不太严重3 .促进了二硫化物键的形成和蛋白质的折叠作用(氧化环境)4.蛋白质的n末端结构正确折叠的塔运输过程中切断信号肽的缺点：1.信号肽并不总是有助于蛋白质的运输2 .可能形成封入体，细胞外周质表达，50，途径：1.以大肠菌细胞固有的途径，将属于真正分泌型的蛋白质直接分泌到细胞外培养基中。 (不是特别有效的程序)2.诱导仅限于大肠菌细胞外膜的漏出，细胞内的蛋白质向细胞外培地方分泌。 (可以分离为中等产量的蛋白质)，细胞外分泌，51，优点： 1，蛋白质的酶解作用低，细胞外分泌的蛋白质种类少，目的蛋白质容易纯化，蛋白质的折叠作用增强，蛋白质的n末端结构是真正的缺点： 1， 在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白通常不分泌到细胞外培养基2，由于分泌到细胞外培养基的蛋白质很稀释，目的蛋白质的纯化过程很复杂，细胞外分泌，52，2，目的蛋白质在酵母细胞中的表达， 酵母表达系统是最成熟的真核细胞表达系统的特征：酵母是最简单的真核生物，在某些方面与原核细胞相似，繁殖速度快，培养和发酵等操作简单，有利于工业生产的许多酵母的遗传背景都很清楚， 基因表达调控机制的研究非常彻底，酵母具有真核细胞的特征，能识别内含子，能在一定程度上翻译和修饰蛋白质，具有分泌功能，不会产生容易纯化蛋白质的毒素，安全性高。53、毕赤酵母是甲醇型酵母(即可以在以甲醇为唯一碳源和能量源的培养基中生长)