血清分类型PPT课件

第八章血清型,附件,目的要求,掌握：血清型的定义；几个主要血清蛋白的分型、检测方法及法医学意义。结合珠蛋白（haptoglobinHp）、维生素D结合蛋白（vitaminDbindingprotein，groupspecificcomponent，Gc）、血清类粘蛋白(orosomucoid，ORM)的遗传多态性分型、群体遗传学调查及检测的基本原理，个人识别机率（DP值）的状况。熟悉：血清蛋白（Hp、Gc、ORM、免疫球蛋白同种异型）在体内的的生化性质及生理功能。遗传多态性的群体分布，普通型及亚型在个人识别中的意义。,人类某些血清蛋白具有遗传多态性，表型有个体差异，称之为血清型(serumtypes)。,一.血清型的概念,据分型原理不同，可分为两大类：1.同种异型遗传标记同一种属不同个体免疫球蛋白抗原性的差异，用免疫学方法测定。免疫球蛋白Gm、Km、Am、-脂蛋白等。,二.血清型的分类与命名,2.血清蛋白的电泳多态性遗传标记不同个体血清蛋白的电泳特性的差异。是血清蛋白多肽链中部分肽链段或个别氨基酸不同，引起电泳迁移率发生变化构成的多态性，这类血清型需用电泳技术分型。,主要有结合珠蛋白（Hp）、维生素D结合蛋白（Gc）、1-抗胰蛋白酶（PI）、转铁蛋白（Tf）、类粘蛋白（ORM）、2-HS糖蛋白（AHSG）、纤维蛋白溶酶原（PLG）、间-胰蛋白酶抑制因子（ITI）、抗凝血酶（ATIII）。,三.分型原理1.免疫学方法可用来进行同种异型遗传标记的分型，以特异性抗体检测同种异型抗原，确定遗传标记的型别。,2.凝胶电泳技术分型在法医学鉴定中应用的血清型多数属于电泳性质上的多态性，需采用凝胶电泳技术分型。,血清蛋白多以糖蛋白的形式存在，糖侧链的电荷也可以影响蛋白电泳迁移率。因此有些血清型在分型之前，样品需经神经氨酸酶(唾液酸苷酶)或其它试剂处理，如转铁蛋白分型。,某些血清型的血液与血痕电泳谱不同，如新鲜血液与血痕中的Gc、Tf蛋白电泳迁移率稍有不同，原因在于他们与其他蛋白质分子的相互作用，并非遗传差异。,3.电泳后血清型谱带的显示：普通蛋白染色、免疫固定法、免疫印迹法1）蛋白质染色：考马斯亮蓝R250、氨基黑和硝酸银染色等；2）免疫固定：为特异性显色方法，主要是利用抗原抗体的特异性反应识别特异性蛋白；3）免疫印迹：为特异性显色方法，利用标记在抗体上的酶或其它标记物显示抗原抗体复合物；4）还可以利用某些血清型的生物化学特性，设计显色方法。,4.DNA分型技术个体表型差异的实质是人类基因组编码DNA序列的差异。,四.法医学意义,自1939年发现血清中Hp的遗传多态性以来，血清型因分型可靠，个人识别率高等原因受到法医学的重视，多种血清型成为亲子鉴定首选的遗传标记。基因重组率低，突变率低，在亲子鉴定中仍有应用价值。,第二节结合珠蛋白型（Haptoglobin，Hp）,一.Hp的生化性质及生物学功能1.生化性质产生：肝脏合成，属2球蛋白(占2球蛋白总量的1/4)；分子结构：糖蛋白，含糖量约19.8%；Hp蛋白由两条链和两条组成。,2.功能,(1)红细胞解体破坏后释出血红蛋白Hb，Hp立即与之结合成Hp-Hb复合物，并很快被网状内皮系统所吞噬，使Hb中的铁得以再利用；(2)大分子Hp-Hb复合物不易被肾小球滤过，防止血红蛋白沉积于肾小管，从保护肾脏。,3.分子结构,Hp由两条链和两条链组成Hp1型与Hp2型之间链一级结构不同，链相同Hp蛋白：两条链：Hp1链、Hp2链两条链(无多态),二、等位基因与命名及表型,（一）Hp基因Hp基因定位16q22.1Hp基因簇：Hp链基因Hp链基因Hp相关基因Hpr,基因Hp*1含5个外显子，在Hp*1基因的基础上，涉及Hp*1基因的第2至4内含子范围，即包括第2、4内含子的部分和第3、4外显子的全部，出现大约1.7kbDNA片段的基因内重复，形成了Hp*2基因。,1.7kb基因内重复图8-1Hp*1和Hp*2基因结构示意图：Hp*1基因有5个外显子、4个内含子,Hp*1第4外显子中第52、53位密码子的不同,Hp*2基因第4外显子中的52位、53位，第6外显子中的111位、112位密码子也具有Hp*1F与Hp*1S的差别,Hp*2FFHp*2Hp*2FSHp*2SS,Hp普通型基因：Hp*1、Hp*2Hp亚型基因：Hp*1F、Hp*1S、Hp*2FF、Hp*2FS、Hp*2SSHp按孟德尔规律呈共显性遗传。,（二）Hp表型,图8-2Hp的PAGE分型谱带,1.普通型Smithies(1955)采用淀粉凝胶电泳技术将不同个体的Hp分为三型：Hp1-1、Hp2-1、Hp2-2型。,2.亚型8mol/L尿素使Hp1-1分子中链变性，用巯基乙醇还原后电泳，发现Hp*1基因产物由Hp*1F、Hp*1S两个基因产物组成。,图8-3Hp-sub型的PAG-IEF电泳分型谱带,（三）Hp遗传变异,大量群体调查表明Hp存在许多遗传变异，分述如下:1.Hp0血液中Hp含量太低，用常规方法测不出Hp表型，称为无结合珠蛋白血症(anhaptoglobinemia);Hp0型在中国汉族人群中约占0.81%，这些个体并无溶血性疾病。,Hp沉默基因是编码Hp链的基因片段缺失所致，缺失DNA包含启动子部分，该基因称为Hp*del。基因型为Hpdel/Hpdel的个体是无结合珠蛋白血症的个体；当Hp*del基因以杂合状态存在时该个体呈现低结合珠蛋白血症。,2.Hp2-1M型称为修饰表型2-1型或Hp2-1(mod)3.HpCa型又称Carlsberg表型4.HpJ-1型5.HpK-1型,Hp2-1MHpCaHpJ-1HpK-1,Hp1Hp2-1Hp2,三.群体遗传学调查结果,Hp表型分布存在一定种族差异亚洲人Hp2-2Hp2-1Hp1-1白人Hp2-1Hp2-2Hp1-1黑人Hp1-1Hp2-1Hp2-2,四.Hp分型原理、方法,（一）聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳(PAG)在柱状凝胶中电泳分离，利用Hp-Hb中的Hb的过氧化酶活性氧化联本胺，从而使谱带显蓝色；血痕无法判型？（二）Hp亚型等电聚焦电泳分型(IEF)不同蛋白质分子之间等电点差异，凝胶电泳分型；（三）DNA分型检测Hp编码序列。,Hp分型,第三节维生素D结合蛋白(VitaminDbindingprotein，DPB)型特异成分(GroupSpecificComponent，Gc),一.Gc的生化性质与生物学功能Hirschfeld1959年电泳发现其多态性1.生化性质Gc由肝脏合成，属2球蛋白正常人血清Gc含量：36.46.0mg%,Gc是糖蛋白，唾液酸含量：Gc1c1.16%，Gc1a0.17%，Gc20.57%。等电点4.85.1，Gc1F(1a)为4.95，Gc1S(1a)为4.96Gc1F(1c)为5.03，Gc1S(1c)为5.04Gc2为5.10。Gc基因产物为含458个氨基酸残基的单一肽链,2.Gc的生物学功能,结合和转运维生素D参与VD代谢的转运和储存过程。,二.遗传及等位基因命名,（一）Gc基因Gc基因定位:4q12Gc为常染色体单一位点共显性遗传基因第11外显子中416位、420位密码子的变化导致Gc遗传多态性,（二）Gc表型,1.聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳可检出Gc*1及Gc*2两个基因产物，将Gc分为三种普通表型。,图8-4Gc型的PAG分型谱带图,图8-5Gc型的等电聚焦分型谱带,2.用等电聚焦电泳可检出三个等位基因产物共六种常见表型,3.变异型及命名双带变异Gc1变异Gc1S正极侧Gc1A带Gc1S负极侧Gc1C带单带变异Gc2变异Gc2正极侧Gc2A带Gc2负极侧Gc2C带,图8-6Gc型的等电聚焦分型谱带含变异型,三.群体遗传学调查结果,Gc亚型的基因频率人种间分布有差异白人Gc*1SGc*2Gc*1F蒙古人Gc*1FGc*1SGc*1FGc*2频率大体相当黑人Gc*1F很高,（一）免疫电泳检测Gc普通型,图8-7Gc型的免疫电泳分型图谱,（二）聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分型,8-8聚丙烯氨凝胶圆盘电泳Gc分型模式图,（三）用等电聚焦电泳技术可检出三个等位基因产物共六种常见表型,图8-9Gc型的等电聚焦分型谱带,第四节血清类粘蛋白(orosomucoid，ORM),血清中的1-酸性糖蛋白1.生化性质及生物学功能来源：肝脏及淋巴细胞合成；分子结构：糖蛋白，含糖量45%，1条多肽链（181个氨基酸）分子量4000041000D;功能：免疫调节功能，急性时相正反应物，感染，炎症，肿瘤时ORM。,2.遗传及遗传多态性ORM基因座位于9q43pter，ORM1，ORM2两个基因座彼此紧密连锁，按孟德尔共显性方式遗传。ORM1具遗传多态性，其等位为ORM1*F1，ORM1*F2，ORM1*S；ORM2在大多数人群中不具有遗传多态性，其基因为ORM2*M。,ORM1表型与基因型,3.群体遗传学调查4.分型方法:神经氨酸酶处理样本+IEF+免疫固定凝胶中不含Triton100凝胶中含Triton100,5.法医学应用评价,1）ORM1血清型个人识别率，非父排除率均较高（DP:0.5992，EPP:17.75%）；2）在血清、血痕、精液及精斑中均可检出；3）在斑痕中保存时间较长。,第五节免疫球蛋白同种异型,同种异型(Allotype)：免疫球蛋白上具有个体差异的抗原决定簇，由编码免疫球蛋白多肽链基因的等位基因所表达产生，表现为同一种属不同个体的免疫球蛋白抗原性不同，具有遗传多态性。用免疫学方法测定。,免疫球蛋白（Ig）的免疫学研究表明，Ig具有抗体活性，能与相应的抗原特异性结合；同时Ig又具有抗原特异性，通过它的免疫刺激可产生相应的抗体。Ig抗原特异性是一种遗传性状。,一、免疫球蛋白的结构1.免疫球蛋白分子结构,2.分类同种型：同一种属所有个体共有的免疫球蛋白抗原决定族，包括免疫球蛋白的类、亚类和型。根据免疫球蛋白重链恒定区氨基酸排列不同及抗原性不同可分为5类。IgG(链)IgA(链)IgM(链)IgD(链)IgE(链),根据IgG和IgA重链恒定区氨基酸排列不同及二硫键的数目和位置不同，可分为不同亚类：IgG：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4IgA()：IgA1(1)IgA2(2)根据轻链恒定区不同可分为两型：型、型,3.同种异型：不同个体的轻链或重链中氨基酸的序列的轻微差异，导致免疫球蛋白抗原决定簇不同，此差异仅局限于轻链和重链的恒定区。,二.免疫球蛋白同种异型的命名与遗传,1命名原则标记名：IgG-Gm(G1m，G2m，G3m),IgA-Am(A2m），IgE-Em，K-Km。抗原名：数字加括号，按IgG1、IgG2、IgG3依次排列，不同亚类的同种异型用“；”隔开，同一亚类用“，”隔开。,例：Gm(1,3;5)Gm(1,2,3;5,21)基因(型)标记名+基因(上标)两个染色体上的基因用“/”分开例：Gm1,3;5/Gm1,3;5，Gm1/Gm1,2;21Gm1,2;21/Gm1,2;21,人类免疫球蛋白同种异型遗传标记,2.遗传1）Gm型遗传：常染色体共显性遗传；Gm系统决定IgG1同种异型的4个主要等位基因是G1m1,17，G1m1,2,17，G1m1,3和G1m3。IgG2有G2m23+和G2m23-两个等位基因。在IgG3上有大量的同种异型。,2）Am系统IgA2亚型上的两个同种异型A2m(1)和A2m(2)受控于一对等位基因A2m1和A2m2。,3）Em系统Em(1)是在IgE上检出的遗传标记。4）Km系统Km系统的等位基因有Km1、Km1,2和Km3三个。Km有三个因子：Km(1)、Km(2)与Km(3)，其中Km(1)和Km(3)为等位基因产物。多数群体调查只使用抗Km(1)一种血清，所以通常的Km1基因频率实为Km1与Km1,2之和。,3.同种异型遗传标记在免疫球蛋白的位置各种G1m因子的氨基酸差异,Km因子位于链的C区,不同位置上氨基酸有差别的同种异型可出现在同一个免疫球蛋白分子上，例如G1m(1)和G1m(17)。同种异型遗传标记通常以单倍型的形式从亲代传给子代。G1m(1)G1m(17)_|_|_214355-358图8-10同种异型为G1m(1,17)的个体在同一重链上具有两种同种异型抗原决定,同种异型受两个相互独立的连锁群基因的控制，一个连锁群基因控制重链标记Gm、Am、Em。在同一条染色体上以单倍型连锁遗传。另一个连锁群基因决定型轻链上的Km遗传标记。,三、群体遗传学调查结果,4、检测方法红细胞被动凝集抑制试验ELISA-I试验,红细胞被动凝集抑制试验原理模式图,1.生化性质与生物学功能来源：肝脏合成PI值：4.2-4.8功能：蛋白酶与蛋白酶抑制物之间的平衡，保护组织免疫蛋白水解酶分解，感染时，PI抑制参与炎症反应酶。分子结构：糖蛋白、含糖量13%。,1-抗胰蛋白酶（1-AT，蛋白酶抑制物PI）,2.遗传及遗传多态性遗传14q3132PI为复等位基因，按孟德尔的共显性方式遗传。普通电泳：、PI*F、PI*SIEF：PI*M1，PI*M2，PI*M3三个产物，基因型：M1，M2，M3，M1M2，M1M3，M2M3。,3.群体分布基因频率：PI*M1PI*M2PI*M34.分型方法酸性淀粉凝胶普通电泳分型。IEF:PI*M亚型5.法医学应用，由于M1频率太高，应用价值有限。,1.生化性质及生物学功能来源：肝脏合成功能：运输铁。铁从肠道吸收，贮存于肝，Tf将铁从肠道及肝运输到利用铁的组织、骨髓，合成Hb用。Tf还参与在Zn的吸收与转运，还具有抗感染能力。,转铁蛋白（transferrin,Tf）,分子结构：糖蛋白，含糖量约6%，1条多肽链（含679个氨基酸），分子量为79570D。PI：5.5,2、遗传及遗传多态性3q21-26，常染色体共显性遗传。普通型:Tf*B、Tf*C、Tf*DTf*C的频率较高，Tf*B和Tf*D的变异型多达20多种，频率很低，未达到多态。,亚型：TF*C1，TF*C2常见的基因型：C1，C2，C2-1,4、分型方法：IEF+免疫固定5、法医学应用,2-HS糖蛋白（AHSG）,1.化学性质与生物学功能来源：肝脏合成，血浆0.40.85mg/ml功能：与骨骼形成，胚胎与婴儿发育有关；是一种急性时相负反应物，组织炎症，高血钙症、成骨不全、外伤等应急状态，AHSG。分子结构：2糖蛋白，含糖约10%。A、B两条多肽链：A链:282个氨基酸；B链：27个氨基酸，分子量49000D。,2.遗传及遗传多态性遗传：3q21-qter孟德尔共显性遗传等位基因：AHSG*1，AHSG*2。,3.群体遗传学AHSG*1频率最高，也发现10余种变异型；其次为AHSG*2。4.分型原理及方法神经氨酸酶处理样本+IEF+免疫固定IEF+免疫固定。,纤维蛋白溶酶原（PLG）,1.化学性质与生物学功能产生：肝脏合成、血清含量0.10.2mg/ml。功能：纤维蛋白溶解，凝血因子降解。分子结构：糖蛋白，含糖量8-10%，1条多肽链（791个氨基酸），分子量93000D。PI：5.6,2.遗传及遗传多态性：6q25-qter，常染色体共显性遗传。PLG*A、PLG*B,3.群体遗传学PLG*APLG*BPLG*M5可能是蒙古人种特有的基因4.分型方法神经氨酸酶处理样本+IEF+免疫固定5.法医学应用：亲子鉴定,间-胰蛋白酶抑制因子(ITI),1、化学性质与生物学功能来源：肝脏合成，血浆含量0.30.5mg/ml功能：抑制蛋白酶活性分子结构：糖蛋白、含糖量8.9%,3条多肽链：轻链：143个氨基酸，16000D；重链：638个氨基酸，78000D，648个氨基酸，85000D三条多肽链由一条氨基多糖共价键连接,2、遗传多态性编码ITI两条重链和一条轻链的基因位于人类不同常染色体上。9q32-33（轻链）3p21.121.2(第一条重链)，具遗传多态性。10p13（第二条重链）ITI等位基因按孟德尔共显性方式遗传。常见等位基因：ITI*1，ITI*2