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文档简介

免疫印迹与免疫沉淀,2011年6月27日,免疫沉淀原理,免疫沉淀相关派生技术,免疫共沉淀（proteincompleximmunoprecipitation,CoIp）：研究蛋白-蛋白相互作用染色体免疫沉淀（Chromatinimmunoprecipitation,ChIp）：DNA-蛋白质相互作用染色体免疫沉淀芯片（ChIp-on-chip）：利用芯片技术高通量研究DNA-蛋白质相互作用RNA免疫沉淀（RNAimmunoprecipitation）：RNA-蛋白质相互作用,免疫印迹技术的原理,Westernblot是将蛋白质样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，通过抗体-抗原相互作用进行特异性检测的方法。,电泳,转膜,抗体孵育,显影,SDS-PAGE蛋白质分离,SDS-PAGE示意图,总蛋白染色（考马斯亮蓝）,转膜,转印膜尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜转膜方式,湿转,半干转,湿转,转膜时间：200mA,1h,丽春红染色鉴定转膜情况,10X丽春红染液：丽春红S2g、三氯乙酸30g和磺基水杨酸30g加水至100ml染色方法：将膜放入染液中5min，后在水中脱色2min脱色：在水中浸泡10min丽春红对膜上蛋白质的染色是可逆的！,封闭,膜上没有结合蛋白的空白位置需要加以封闭，以避免与抗体的非特异性结合。过度的封闭会导致目的抗原表位的遮蔽，从而降低灵敏度，不完全封闭会导致最终背景增高或信噪比降低。封闭液：含有5%脱脂奶粉的TBST封闭时间：室温1h,抗体孵育和显影,抗体孵育,一抗直接测定：膜背景低、简单、快速二抗间接测定：可能有交叉反应，灵敏度高二抗标记物：辣根过氧化酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、生物素、荧光素,酶与底物的孵育,显色底物：DAB底物在HRP和过氧化氢存在下，失去电子而显出棕色发光底物：HRP与底物反应发出强光，可见光信号可用压片法检测,结果检测,DAB显色对膜进行直
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