发酵工程的研究状况和进展.ppt

1,发酵工程的研究状况和进展,陈坚江南大学jchen,2,发酵工程的研究状况,3,生物质原料,化学品精细化学品大宗化学品食品添加剂生物塑料溶剂酚类粘合剂脂肪酸碳黑、颜料燃料、香料、墨水洗涤剂,生物能源生物酒精生物柴油甲醇氢气沼气,工业生物技术主要部分-发酵工程,4,发酵工程,广义的概念：生物学(微生物学、生物化学)和工程学(化学工程)结合,狭义的发酵概念：微生物培养和代谢过程,微生物生长,底物消耗,产物生成,5,获得应用价值的微生物,反应器及过程放大,发酵过程优化和控制,发酵工程研究,发酵产物分离提取,6,发酵工程的关键问题和工程意义,微生物能够积累最大目的产物(产量)的条件是什么？,高产量便于产品分离提取,关键问题1,工程意义1,相关：微生物生理、遗传特性和营养、环境因素,7,底物最多被微生物转化为产物(转化率)的条件是什么？,粮食原料为底物高转化率降低原料成本,关键问题2,工程意义2,相关：微生物代谢途径和过程条件,发酵工程的关键问题和工程意义,8,微生物最快速度发酵生产目的产物的条件是什么？,分批操作为主高生产强度缩短生产周期,工程意义3,关键问题3,相关：微生物反应动力学和系统优化,发酵工程的关键问题和工程意义,9,条件确定,过程优化,初始条件,过程分析,过程强化,发酵优化的研究思想：发酵是一个过程,10,基于细胞表观特性进行优化,基于细胞内部分析进行优化,高产量,高底物转化率,高生产强度,优化策略,在理论和技术上有突破,在工业生产中能广泛应用显著提高发酵过程的经济性和科学性,研究方法,11,1基于微生物反应原理的培养环境优化技术,优化微生物生长的物理和化学环境保证微生物生长处于最适条件,基本思想,奠定基础,基于底物运输、生化反应、产物排出,确定不同环境条件对微生物生长和代谢产物分布的影响,Prod.Distribution,发酵优化,12,培养基组成的优化技术发酵环境条件的优化技术,确定培养基组分的最小用量，避免底物的过量或不足减少副产物的形成，使底物转化率明显提高对关键物质的浓度及其供给方式进行优化，使目标产物产量明显提高分析不同环境条件下微生物的生理学,目的,内容,13,2基于微生物代谢特性的分阶段培养技术,研究思想,发酵优化,14,利用分阶段培养技术还可以将细胞生长期和产物形成期人为分开，从而实现优化发酵过程的目的。,T，pH,DO,RPM,15,3基于反应动力学和人工智能的优化和控制技术,研究思想,建立动力学模型，求解参数并评价其适用性,对发酵进程和产量指标进行预测,以数学模型为基础的优化,优化发酵过程,发酵优化,16,以生理模型为基础的优化,采用人工神经网络、专家系统、模糊逻辑控制技术,对发酵过程进行在线状态预测和模式识别,自适应最优化控制系统的开发、计算机模拟和实际应用,17,4基于代谢通量分析的过程优化技术,研究思想,发酵优化,18,分析不同发酵产品合成途径中主要代谢节点的性质，结合发酵过程中胞内能量代谢情况，提出一系列发酵优化策略。,目的,19,长期胁迫可遗传性的应答（遗传变异）短期胁迫不可遗传性的应答（生理性的),Pyruvate,NAD+,NADH,ADP,ATP,ethanol,Anaerobic,Aerobic,Mitochondrion,ATP,环境压力或胁迫饥饿、高温、高压、机械剪切、冷冻、强酸、强碱、高渗透压（高盐）、活性氧、有毒化学物质等等,细胞结构、基因转录和蛋白表达的临时改变，酶原的激活以及代谢途径的临时调整等,5基于环境胁迫条件下微生物生理应答的过程优化技术,发酵优化,20,研究一些重要的工业微生物的抗胁迫因子及其抗胁迫机制，考察环境胁迫条件下特定微生物蛋白转录和代谢途径变化，采用不同环境胁迫手段或措施对微生物的生长或代谢进行调控，促进微生物生长或大量合成目的产物。,学术思想,21,学术思想,6基于微生物代谢的辅因子调控的过程优化技术,发酵优化,研究辅因子形式及其浓度在物质代谢和信号传递途径中控制代谢流方向和流量分配的作用机制、物质流和辅因子流的变化规律，对微生物的生长或代谢进行调控，促进微生物合成目的产物的代谢流的最大化和快速化。,22,细胞功能认识和优化,生物学知识和技术,发酵工程的未来,23,工程学方法和规律,工业生物过程,细胞群体效应,生化、生理特性分析,物质和能量传递模型,过程放大原理和策略,发酵优化,系统全局优化与集成,过程优化,细胞群体效应调控的直接放大,生物/化学方法级联的系统优化,多产物联产目标的全局调控,发现和认识,创新技术和方法,集成优化,细胞群体,单元过程,系统优化,反应/分离单元耦合集成,生物/化学级联方法,多目标联产方法耦合技术,基于生理特性的直接放大,过程集成,发酵工程的未来,24,发酵工程研究举例,25,举例1：丙酮酸发酵,Glucose,Pyruvate,Alanine,Acetaldehyde,Ethanol,Citrate,OAA,-KG,AcCoA,Pyruvate,OAA,B1：硫胺素NA：烟酸Bio：生物素B6：吡哆醛,光滑球拟酵母中丙酮酸代谢途径,如何得到丙酮酸高产量发酵？-菌株选育和培养条件优化,选育自身不能合成维生素的酵母(维生素缺陷型)控制培养基中维生素浓度,LiY，ChenJ，LunS.Appl.Microbiol.Biotechnol.2001,55:680-685,57:471-479.LiY,ChenJ,LiangD,LunS-Y.J.Biotechnol.2000,81:27-34,26,动力学分析,如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度？-分阶段溶氧控制,27,高产量(89.4g/L)高产率(0.636g/g)高生产强度(1.95g/(Lh),碳平衡分析,前16h较高溶氧有利于碳流合成细胞；,采用单一高或低供氧模式，不能同时达到高转化率和高生产强度！,16h后耗氧速率恒定，碳流转向合成丙酮酸,结果,如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度?-分阶段溶氧控制,分阶段溶氧控制！如何分阶段？,LimingLiu,*JianChen.BiotechnologyandBioengineering,2007,97(4):825-832,LimingLiu,*JianChen.JournalofBiotechnology,2006,126(2):173-185,28,如何使酵母从积累丙酮酸转向积累-酮戊二酸辅因子调控,打开丙酮酸脱氢酶系(PDH)途径,打开丙酮酸羧化酶(PC)途径,29,LLiu,YLi,ZShi,GDu,*JChen.MetabolicEngineering,2007,9(1):21-29,从积累丙酮酸转向积累-酮戊二酸,同时打开,添加Ca2+离子，PC活性受Ca2+所激活,30,举例2：维生素C发酵微生物的功能优化与调控,我国是世界最大的维生素C生产国和出口国，2008年生产85000吨，产值40亿，占世界市场90,小菌(氧化葡萄糖杆菌G.oxydans),大菌(巨大芽孢杆菌B.megaterium),关键科学问题：维生素C发酵微生物的功能关系,Glu,Vc,现况：维生素C两步发酵工艺小菌单独培养生长、产酸困难大菌本身不产酸，促进小菌生长和产酸,团队承担的国家863重点项目和国家支撑项目,与南开大学功能基因组学中心、国内最大Vc生产企业合作,实现组学技术解决发酵工业长期问题的典型,31,基因组测序步骤,鸟枪法测序,提取基因组DNA,打断基因组DNA,基因文库构建,大规模测序,罗氏GSFLX高通量基因组测序,衔接子连接,单链DNA与磁珠结合,油滴中PCR反应,序列拼接,测序反应,填补缺口,基因组注释,代谢途径分析,小菌测序,大菌测序,代谢途径分析,代谢途径分析,从代谢途径角度解析两菌关系,32,氧化葡萄糖酸杆菌中心代谢途径分析,缺失编码琥珀酸盐脱氢酶的基因，柠檬酸循环不完全,无编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，不能通过糖异生生产C6,G.oxydans基因组含编码氧化戊糖磷酸途径和D途径的全部酶基因,缺失编码磷酸果糖激酶的基因，糖酵解途径不完全,33,蛋白质组学,小菌单独发酵时胞内蛋白表达,大菌存在时小菌胞内蛋白表达,功能蛋白确定，研究大菌影响小菌产酸的机制,K.Vulgar,B.megaterium,34,发酵优化,提高糖酸转化率提高VC产量提高生产强度,基因测序,功能蛋白,产物解析,3-磷酸甘油醛,丙酮酸,葡萄糖,TCA循环,大菌特定的代谢途径,Vc,目标1：确定微生物之间的功能关系，提高效能,目标2：构建Vc一步发酵菌株，实现重大创新,举例2：维生素C发酵微生物的功能优化与调控,35,举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术,36,高产菌株选育,产酶微生物筛选,菌株鉴定和遗传改造,分子克隆和工程菌构建,发酵过程研究,酶的分离与纯化,培养基和条件确定,发酵过程优化策略,过程放大和工业化,分段控制,流加发酵,低成本,放大技术,分离与纯化方法,酶的基本性质,工业化提取技术,诱导胁迫,举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术,37,酶制剂应用,酶应用特性和作用机理,复合酶和酶组分复配,过程模拟和最佳条件,应用效果评价,应用效果比较研究,经济学评价,环境效益分析,举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术,38,野生菌筛选与发酵,提取高纯度天然蛋白,电泳,主要斑点N端测序或肽指纹术分析,N端序列/肽段分子量数据库查询,获得基因,N端测序,设计核苷酸探针杂交,获得基因,生物数据库查询同源序列,保守序列分析设计引物扩增相关序列片断,获得基因,若出发菌基因组序列为已知,若出发菌基因组序列未知,Thermobifidafusca角质酶,角质酶高产菌的构建,细菌来源角质酶编码基因目前在国内外未有报道,酶制剂基因鉴定流程,举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术,39,TableISummaryofpurificationofwild-typecutinasefromT.fusca,天然嗜热子囊菌角质酶的纯化,通过硫酸铵沉淀、疏水色谱、阴离子交换色谱从嗜热子囊菌发酵液中分离纯化得到电泳纯天然角质酶,角质酶高产菌的构建,举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术,40,肽指纹图谱鉴定角质酶基因,对电泳纯天然角质酶进行肽指纹图谱分析，通过数据库比对，得到角质酶的编码基因(Tfu_0883),角质酶高产菌的构建,举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术,41,Tfu_0883的克隆、表达和纯化,通过基因工程手段使角质酶基因在大肠杆菌中高效表达，工程菌发酵液酶活达180U/mL，是野生菌产酶的9.4倍。,重组Tfu0883具有角质酶活性,pET-20b(+),pelBassignalpeptide,C-terminalHis-tagE.coliBL21(DE3)RossettaAmmoniasulfateprecipitation,Ni-column,角质酶高产菌的构建,举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术,42,调控PGL发酵过程中底物甘油的浓度和诱导物甲醇的浓度，实现PGL的高产量和高生产强度,前期研究结果举例：甲醇和菌体浓度比值的影响,底物流加研究目标,流加策略,甲醇流加：控制甲醇流速，将甲醇和菌体浓度比值维持在0.165g/g左右,甘油流加：细胞快速生长，达高密度；,重组P.pastoris高密度发酵生产PGL的底物流加策略和温度诱导,举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术,43,菌体生长阶段的甘油流加策略,细胞干重在63h达到122g/L,细胞干重在33h达到140g/L,DO-stat,指数流加,重组P.pastoris高密度发酵生产PGL的底物流加策略和温度诱导,举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术,44,诱导阶段的甲醇流加策略,图2-6甲醇流加控制下的发酵过程曲线DCWPGLMethanolFeedingrateqs1000DO,诱导前期(08h)以2ml/h的速度逐步提高甲醇流加速度，使培养液中甲醇浓度接近20g/L；(2)诱导中期(890h)将甲醇流加速度控制在9.7mL/h以维持体系中甲醇浓度为20g/L；诱导后期(90h以后)，DO上升，将流速维持在2mL/h。,成功将甲醇与菌体浓度比例控制0.1630.171g/g。发酵结束时PGL酶活达到430U/mL，生产强度达到4.34U/mL/h。,重组P.pastoris高密度发酵生产PGL的底物流加策略和温度诱导,举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术,45,举例4：透明质酸发酵过程优化与控制,透明质酸三级结构,优良理化性质：粘弹性高保湿性生物相容性,食品添加剂,关节炎治疗,化妆美容,高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈,乳酸对细胞生长和HA合成有着较强的抑制作用,细胞生长和HA合成之间存在对碳源和关键辅因子的竞争,HA发酵存在问题,46,透明质酸发酵过程的混合与传质特性优化研究,问题(),高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈,溶氧水平,表观黏度,有效搅拌区域体积,溶氧传递系数,有效搅拌区域模型,有效搅拌区域控制模型的混合与传质动力学(Va=1）,剪切力对菌体形态影响,理想HA发酵模式：低剪切、高传质、高溶氧,47,降解透明质酸提高发酵过程的混合及传质效率,问题(),高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈,酶法降解HA提高混合与传质效率,氧化还原降解HA提高混合与传质效率,FT-IR分析结果,过氧化氢/抗坏血酸氧化还原降解HA,氧化还原降解HA没有破坏其基本结构单元,HA氧化还原降解对HA发酵的影响,添加H2O2/抗坏血酸对流体力学影响,48,Transglutaminase(TGase,Proteinglutamine-glutamyltransferase,EC2.3.2.13),举例5：Transglutaminase:ActivationMechanismandFermentationOptimization,通过N-(-谷酰胺)赖氨酸键交联蛋白质催化蛋白质中Gln的-羧酰胺基与伯胺间发生转移反应蛋白质脱酰胺作用通过形成脂键共价连接蛋白质和脂肪酸的长链-羟基目前唯一商业化并大规模生产的可在蛋白质间形成共价交联的酶制剂,49,ActivationMechanismofTransglutaminase,TAPI:surfactantprotein,举例5：Transglutaminase:ActivationMechanismandFermentationOptimization,50,根据该TGase活化模型：在发酵过程的产酶初期:*添加10mg/mL的CTAB，使发酵过程酶活提高21.8%；*添加1000U/mL的胰蛋白酶，使发酵过程酶活提高31.2%。,举例5：Transglutaminase:ActivationMechanismandFermentationOptimization,51,TransglutaminaseFermentatio