大学微生物课件第二章.ppt

第二章纯培养和微生物微技术，概念：培养：在人工特定条件下通过培养和繁殖获得的微生物种群称为培养。纯培养：只有一种微生物的培养称为纯培养。第一节微生物1的分离和纯培养。无菌技术1。概念，无菌技术：在分离、转移和培养过程中防止纯培养物被其他微生物污染的技术称为无菌技术。灭菌：指杀死所有微生物的营养物、孢子和孢子。消毒：指消除病原体和有害微生物的营养素。接种：在无菌条件下将微生物从一个培养容器转移到另一个培养容器的过程称为接种。(1)玻璃器皿：试管、移液管、玻璃烧瓶、平板等。干热灭菌、高压蒸汽灭菌，(2)接种工具：接种针、接种环(镍铬合金)、接种铲、酒精灯、镊子、手术刀等。火焰燃烧灭菌，(3)培养基：固体培养基、半固体培养基和液体培养基。高压蒸汽灭菌，(4)无菌水：试管(4.5毫升，9毫升)，锥形瓶(90毫升，99毫升)等。高压蒸汽灭菌，(3)无菌室、无菌箱和洁净工作台，(1)无菌室：面积67平方米，缓冲室、滑动门、与墙面齐平的门、紫外线灯、内部无菌箱和洁净工作台。使用前，进行表面消毒和空气消毒(甲醛、甲酚皂等。紫外线等。)，(2)无菌盒：长143厘米，宽86厘米，高70厘米，是一个封闭的盒子。消毒方法与无菌室相同，(3)洁净工作台：一个封闭的台面盒，其大小与无菌盒相似。它的机制是通过一个马达吹空气，空气通过一个细菌过滤器，所以它是无菌的。用酒精等消毒。紫外线灯照射2030分钟，提前30分钟打开电机。返回，4。无菌环境：火焰面、无菌箱(室)、洁净工作台。5。接种方法：固体菌种或液体菌种与试管(斜面、半固体和液体)、培养皿和三角瓶等相连。1878年，李斯特用一个微型注射器和一个酒杯培养装置来分离乳酸链球菌。注射器的最小抽吸体积为0.00062毫升，纯培养物用液体培养基分离。第二，用固体培养基分离纯培养物。菌落：单一微生物在合适的固体培养基的表面或内部生长繁殖到一定程度，形成具有一定形态结构的可见子细胞生长群，称为菌落。1.概念：草坪是指固体培养基表面的许多菌落连成一片的事实。plate:cultural plate的缩写，指将熔化的固体培养基倒入无菌盘中，冷却并固化后，含有固体培养基的平板。分离方法(1)稀释倒置板法(倾注板法)稀释：用无菌水以一系列稀释度(例如1:10，1:100，1:1000，1:1000，133601000.)。倾倒：分别取少量不同的稀释液，与已融化并冷却至50左右的琼脂培养基混合，摇匀，倒入已灭菌的培养皿中。培养：在合适的温度下培养。缺点：热敏细菌容易死亡；影响严格好氧细菌的生长。(2)涂布平板法，稀释：待分离的材料用无菌水连续稀释。制作无菌板：将融化的培养基倒入无菌板。涂布：分别取少量(0.1毫升或0.2毫升)不同的稀释液滴在平板表面，然后用无菌玻璃涂布棒将菌液均匀分散到整个平板表面。培养：在合适的温度下培养。(4)稀释摇瓶法：适用于制作对氧敏感的厌氧菌培养基(试管、灭菌等)。)培养基熔化并冷却至50接种无菌液体石蜡和固体石蜡密封培养菌落形成取出琼脂柱切片观察移植特点：工艺通用，简单易行。(3)用液体培养基分离纯培养物，适用于微生物：一些大细胞细菌、原生动物和藻类。液体培养基的制备(试管装载、灭菌等。)样品系列稀释接种培养观察。将液体样品稀释到一定的稀释度，大多数(95%)没有生长，可以获得纯培养物。缺点：只有优势可以分离，工作量大，成功率低。(4)单细胞(单孢子)分离概念：采用单细胞(单孢子)分离方法，从混合群体中直接分离单细胞或单个个体进行培养，获得纯培养物。较大的微生物：在解剖显微镜下用毛细管提取多次转移到培养基上纯培养；较小的微生物：单个微生物用毛细管或微针挑取，在显微操作仪器下钩环纯培养。缺点：难度大，专业化程度高。(5)选择培养和分离。对于混合菌群中数量较少的微生物，传统的平板分离法不能达到分离的目的。优势菌：108个/毫升每个平板有10个稀释10-6的菌落样品，0.1毫升待分离的细菌103个/毫升每个平板有10-4个菌落，对于待分离的细菌，每10000个平板可以获得一个菌落。选择性培养分离：通过选择性培养对微生物进行纯培养分离的技术称为选择性培养分离。选择性培养分离包括培养基成分的选择和培养条件的选择。(1)用选择性培养基直接分离。选择性培养基：使用不同培养基成分来抑制大多数细菌并有利于一种或某种细菌生长的培养基。产蛋白酶菌株：牛奶或酪蛋白平板接种培养蛋白水解循环分离筛选优良产蛋白酶菌株；抗生素抗性菌株：抗生素被添加到平板上，只有抗性菌株才能生长。(抗生素是微生物的一种特殊代谢产物，它选择性地抑制或杀死其他微生物)。滑行细菌：螺旋体、粘细菌、蓝细菌等。可以在平板的表面或内部滑动，种子和培养物在平板上，从滑动前部挑选接种物，并重复分离以获得纯培养物。产纤维素酶和产淀粉酶珠的筛选。富集培养：制定特定的环境条件，使其只适合微生物在这种条件下的旺盛生长，从而大大增加其在环境中的数量。这种培养方法称为富集培养。富集条件：温度、酸碱度、紫外线、高压、光、氧、营养等。嗜热细菌：在高温下培养。降解对羟基苯甲酸(酚类化合物)的细菌，有六种，二元培养物，如果培养物只含有两种微生物，并且是有意识地保持两种培养物之间的特定关系，则称为二元培养物。病毒和宿主；纤毛虫或变形虫和细菌；厌氧菌和好氧菌。适用于不能培养或制备纯培养基的非常困难、非常麻烦的微生物。菌种保藏原则：根据菌种的特性和保藏目的，微生物菌种的代谢水平会因水分、温度和营养条件的变化而降低，甚至完全停止，如干燥、低温、缺氧、畏光、营养缺乏等。达到半休眠或完全休眠状态，使微生物菌株能够存活并持续一定时间。(1)继代培养保存法，(1)斜面法的基本方法，菌种转移至适当斜面(最好用带盖的螺旋试管)培养健壮的菌体或成熟孢子用油纸包裹棉塞4冰箱保存定期转移试管。(1)菌株简单易操作，可随时观察微生物变化，适合短期保存。(2)保存时间短(保存时间通常为24个月)，需要定期传代培养，易污染，易降解。(2)液体石蜡法：斜面良好的菌种加入无菌液体石蜡盖上试管盖4放置冰箱保存。特点：保存时间一般为12年。没有必要频繁转移。缺点：需要站直，占用空间大，不要换随身携带。2。冷冻保存法，微生物处于冷冻状态以保存、保护剂如甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、脱脂牛奶等。可以提高存活率。液氮保存方法：-196，需要专用设备，适合专业保存，是理想的保存方法；-70低温冰箱；-20-30普通冰箱。(1)砂管保存，(1)河砂处理：向河砂中加入10%盐酸，煮沸30分钟除去有机物，洗涤至中性，干燥，过筛备用。(2)河沙灌装管的灭菌：将约1g河沙装入10100mm试管中，盖上棉塞，灭菌，干燥。(3)菌悬液的制备：取新鲜斜面菌，加入23mL无菌水冲洗菌苔，制成菌悬液。(4)分装样品：每个砂管中装有0.5毫升细菌悬液，并用接种针混合均匀。其特点是干燥、低温、隔氧、无营养。保鲜效果好，制作简单。该方法适用于产芽孢微生物，如芽孢杆菌、霉菌、放线菌等。保存时间可以达到几年甚至几十年。(5)干燥：防止装有菌悬液的砂管进入干燥机进行真空干燥，并用橡胶塞密封。储存：4冰箱储存。(2)滤纸法，滤纸条的制备：将滤纸切成0.51.2厘米的小条，放入0.68厘米的安瓿中，每管装1-2片，盖上棉塞，灭菌。(2)保护剂配置：将20%脱脂牛奶放入试管中灭菌；(3)菌悬液的制备：向菌种斜面试管中加入2 3毫升无菌脱脂牛奶，制成菌悬液。(4)分装样品：用无菌滴管吸取细菌悬液，滴在安瓿管内的滤纸条上，每条滤纸条为0.5毫升，并用棉条填塞。(5)干燥：抽真空干燥。(6)熔融密封保存：密封在火焰上，4冰箱保存。保存期是几年甚至几十年。该菌株在冷冻状态下升华以获得干燥的菌体样品，其在真空或惰性气体环境中低温保存。(3)冷冻真空干燥是目前最有效的菌种保藏方法之一，具有干燥、低温和缺氧条件，适合大规模保藏。缺点：操作复杂，技术要求高。中国科学院典型培养物收集委员会、中国通用微生物收集管理中心、中国病毒收集中心、细胞库、昆明细胞库、基因库、植物离体种质库、珍稀濒危特有植物种质库、海洋生物种质库、淡水藻类种质库、第二节显微镜和显微镜技术。人眼的正常分辨率通常约为0.25毫米，大多数微生物的大小都在0.25毫米以下。因此，必须用显微镜进行观察。被观察的物体越小，放大倍数越大，否则很难看清！分辨率：区分两点之间最小距离的能力。对比度：观察到的物体与背景相区别的程度。一、正确使用显微镜和良好的标本制作和观察技术，镜头架、支架、载物台、调节螺丝、物镜、目镜、聚光镜、虹彩光圈、光源、光学系统、机械装置，(1)普通光学显微镜、单目生物显微镜、双目生物显微镜，1。油镜的使用方法，首先用低功率镜找到待观察的样品区域；用粗调器抬起镜筒，然后将油透镜转到工作位置；一滴滴芳香的沥青；使用粗调器，小心降低透镜镜筒，使油透镜浸没在透镜油中，并几乎与样品接触。用粗调器慢慢抬起镜筒，当图像出现在视野中后，用微调器将图像调至清晰。2。透镜油的影响，折射率：空气1.0，水1.33，香脂1.52，玻璃1.55，(2)提高分辨率，分辨率=0.5/nsin是所用光源的波长(450700nm)是物镜角度的一半n，载玻片和物镜之间介质的折射率nsin也表示为数值孔径值，最大分辨率：0.18m工作距离：0.1mm，(1)提高照明亮度，(2(4)荧光显微镜，原理：一些化合物(荧光素)能吸收紫外线，并以较长的光波发射部分可见光，从而变成荧光。在紫外线的照射下，荧光物体在黑暗的背景下会呈现出明亮的彩色物体。这是荧光显微镜技术的原理。(5)透射电子显微镜，1933年由德国人罗斯卡首先发明；显微镜的分辨率取决于波长。理论上，电子波的最短波长可达0.005纳米(光学显微镜的最短波长为450纳米)。因此，电子显微镜的分辨率比光学显微镜高得多。其工作原理与光学显微镜非常相似，主要区别在于：(1)电子显微镜镜筒需要高真空；(2)电子显微镜利用电磁环使“光”会聚聚焦；(3)荧光屏须用作显示，或摄影胶片须用作记录。蚊子在电子显微镜(6)、扫描电子显微镜(扫描电镜)、电子束、透镜效应、探针、样品表面扫描、二次放电、电信号采集、