逆境胁迫水稻幼苗及其生理指标分析

植物生物学实验逆境胁迫水稻幼苗及其生理指标分析,实验一：水稻幼苗对盐胁迫的反应实验二：用氮蓝四唑法测定植物超氧化物歧化酶活力,一、实验目的,了解植物如何对逆境胁迫产生反应。观察分析水稻幼苗盐胁迫后发生的形态生理指标变化，用于指导农业生产。,实验一：水稻幼苗对盐胁迫的反应,二、实验原理,逆境或胁迫（Stress）：对植物产生伤害的环境。,逆境胁迫,生物因素,非生物因素,温度：低温(冷害、冻害)，高温热害水分：干旱，湿害、涝害盐害酸雨紫外线（UV）营养亏缺、重金属,病害虫害杂草,逆境胁迫对植物伤害的表现,形态变化：生长停滞，叶片萎蔫、卷曲、变黄、枯死等。生理生化：叶绿素含量减少，光合速率下降，呼吸速率下降或升高，细胞膜系统破坏，酶活性紊乱等。,植物对逆境胁迫的适应,适应方式：避逆性（stressavoidance）：植物会在时空上躲避开不良环境，如沙漠植物只在雨季生长、阴生植物在树荫下生长等。耐逆性（stresstolerance）：植物能够忍受逆境的作用。适应的形态生理变化：形态变化：如干旱条件下叶小、根系发达；淹水时扩大根部通气组织；冬季低温来临前生长停止、进入休眠等。,生理变化：1.生物膜结构改变，形成胁迫蛋白，如热激蛋白、抗冻蛋白等。2.保护酶系统受破坏由超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等组成的保护酶系统会降低或消除活性氧的危害。正常情况下，细胞内自由基的产生和清除处于动态平衡状态，自由基水平很低，不会伤害细胞。遭受逆境胁迫时，细胞内自由基积累过多，SOD等保护酶系统被破坏，产生许多有害的过氧化产物如丙二醛等，会伤害细胞。自由基会破坏膜结构，损伤大分子生命物质，引起一系列生理生化紊乱，导致植物死亡。,活性氧：阴离子自由基、羟基自由基(-OH)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)，具有很强的氧化能力、对许多生物功能分子有破坏作用、引起膜的过氧化作用。自由基：具有未配对价电子的原子或原子团。天然的非酶自由基清除剂有维生素E、谷胱甘肽、抗坏血酸、类胡萝卜素等。3.增加渗透调节物质，有利吸水：糖、有机酸、一些无机离子如K+，其中脯氨酸是最有效的。4.增加脱落酸(ABA)含量。,植物盐胁迫,盐胁迫（盐害）：土壤盐分过多对植物造成危害。通常土壤含盐量达0.2-0.5%时就不利于植物生长，主要盐分：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠等。盐土：氯化钠和硫酸钠较多的土壤。碱土：碳酸钠和碳酸氢钠较多的土壤。盐碱土：含盐量0.6-10%。若盐胁迫强度较小，除盐后，植物生长可以恢复；若盐胁迫强度较大，除盐后，植物生长不可恢复盐害,植物对盐胁迫的适应,根据植物抗盐能力大小分为：盐生植物：耐盐范围1.5-2.0%，如碱蓬、芦苇、红树植物等。甜土植物（非盐生植物）：耐盐范围0.2-0.8%，如甜菜、高粱等大多数农作物。,盐生植物的避盐机制,避盐：植物通过某种方式将细胞内盐分控制在伤害阈值之下，以避免盐分过多对细胞伤害。泌盐：植物通过茎、叶上专门分泌盐分的盐腺(或盐囊泡)将盐分分泌到体外，减少或避免盐分对植物的伤害，如红树植物。稀盐：植物通过吸收大量水分和加速生长，稀释细胞内盐分浓度，并将盐分积累在茎叶的肉质化组织，维持体内盐分浓度的恒定，如碱蓬。拒盐：植物对盐有一定的选择性吸收，并能将盐分重新分配在植物的安全部位，从而降低盐分对地上部的伤害，如芦苇、灯芯草。,泌盐的红树植物（盐腺）,稀盐的碱蓬（肉质化）,拒盐的盐生植物,芦苇地上部分拒盐,灯芯草地上部分拒盐,植物盐胁迫的伤害表现,生理干旱：土壤中盐分过多使土壤溶液水势下降，导致植物吸水困难，甚至体内水分有外渗的危险，造成生理干旱。离子失调：植物由于过多吸收某种盐类而排斥对另一些矿质盐的吸收，导致营养缺乏或产生毒害作用。代谢破坏：叶绿体解体、光合速率下降；蛋白质合成受抑制、分解加强，产生有毒物质，对细胞产生毒害。膜透性改变：高浓度NaCl可置换细胞膜结合Ca2+、K+，膜结构破坏、功能改变，细胞内K+、有机质等外渗。,三、实验试剂与材料,试剂：氯化钠主要仪器与器皿：电子天平，低温冰箱，烧杯，容量瓶，量筒，PE手套等。材料：水稻幼苗胁迫方式：盐胁迫，配制浓度00.3mol/L。,四、实验步骤,1.自己设计配制2个不同盐浓度的NaCl溶液并设置对照(CK)。2.挑选生长整齐一致的水稻秧苗60-90株，然后随机取10-15株于1个烧杯中，观测记载描述盐胁迫处理前各杯水稻秧苗的农艺形态性状(如苗高、叶片颜色、叶片数等)。3.各杯分别加入不同浓度NaCl溶液50ml左右（原则：根系要浸入溶液中），然后放置在实验架上进行盐胁迫处理。4.处理12-24h后(具体应视情况而定)，当高盐度处理的秧苗叶片开始出现卷曲时，观测记载处理后各杯秧苗农艺形态性状的变化，然后将各杯的秧苗叶片分别剪下、随机称取少量叶片0.2-0.5g，放入PE手套中并做好标记，置于冰箱冷冻保存备用。,五、实验分组,四个人组成一个小组进行水稻幼苗盐胁迫反应实验。每小组设置3个处理：1个对照和2个不同盐浓度，每处理2个重复，共6份样品。注意每杯要做好自己的标记、写上组别或姓名。,预习下周实验：应用氮蓝四唑（NBT）法测定植物超氧化物歧化酶（SOD）的活力。,植物生物学实验逆境胁迫水稻幼苗及其生理指标分析实验二：用氮蓝四唑（NBT）法测定植物超氧化物歧化酶（SOD）活力,一、实验目的,学习掌握用氮蓝四唑（NBT）法来测定植物超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）的活力。了解不同盐浓度胁迫对水稻幼苗叶片SOD酶的影响。,二、实验原理,SOD发现：1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到SOD。SOD分布：广泛分布在各种生物体内，其活性高低可作为抗衰老的指标。SOD类型：SOD是含Cu、Zn、Mn、Fe金属元素、能清除超氧阴离子自由基的酶，其类型有Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。,SOD测定方法,直接法：脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法、核磁共振法。间接法（化学法）：邻苯三酚自氧化法、细胞色素C还原法、羟胺法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、肾上腺素法等。免疫法：放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA法等。超氧阴离子自由基寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活性，因而采用间接测定法。常用有3种：氮蓝四唑（NBT）光化还原法、邻苯三酚自氧化法、化学发光法。,在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，还原的核黄素极易再氧化而产生氧自由基，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm处有最大吸收。而SOD可清除氧自由基，从而抑制了甲腙的形成。光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。,酶单位/样品量=,NBT法测定SOD酶活性的原理,核黄素：在有氧物质存在下，还原的核黄素与氧反应产生氧自由基。氮蓝四唑(NBT)：氧自由基将无色(或微黄)的NBT还原为蓝色甲腙。甲硫氨酸：电子供体提供核黄素的还原反应所需的电子供体，使得核黄素的光激发还原反应得以进行。SOD酶：SOD通过催化氧自由基歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色甲腙形成。SOD催化反应如下：,（1）在一定盐度的胁迫下，植物叶片中SOD活性随盐浓度的升高而增强。（2）SOD酶能有效抑制膜脂过氧化作用，具有一定的保护作用。因此，盐胁迫的损伤在一定范围内是可以修复。膜系统的修复与SOD、CAT、POD等抗氧化酶的活性和抗坏血酸(ASA)、谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物含量的变化密切相关。,盐胁迫对植物叶片SOD酶的影响,二、实验材料、仪器与试剂,材料：水稻幼苗盐胁迫处理后的叶片。仪器设备：电子天平，高速台式离心机，分光光度计，移液器，荧光灯（反应试管处照度为4000Lx），试管数支，研钵，烧杯，离心管，量筒等。试剂：SOD抽提液：50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）14.5mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：现配现用。2.25mmol/L氮蓝四唑溶液（NBT）：避光保存，现配现用。60mol/L核黄素溶液：避光保存，现配现用。3mol/LEDTANa2溶液,主要试剂配制（供参考）：（1）50mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.8）：A液：NaH2PO42H2O（分子量156.01）：3.12g溶于蒸馏水，定溶至100ml。B液：Na2HPO412H2O（分子量358.14）：7.17g溶于蒸馏水，定溶至100ml。取A液8.5ml与B液91.5ml混合，定容至400ml，pH7.8。（2）SOD提取液：50mmol/L磷酸缓冲液含0.1mmol/LEDTA；0.3%(w/v)TritonX-100；2-4%（w/v）聚乙烯聚吡咯烷酮（PVP）,pH7.8。即每升磷酸缓冲液中加20gPVP，200l0.5mol/L的EDTA母液，3mlTritonX-100。,（3）14.5mmol/L甲硫氨酸（分子量149.21）：称2.163g溶于蒸馏水，定溶至1000ml(较难溶，需稍微加热）。（4）2.25mmol/LNBT（分子量817.7）：称92mg溶于50ml50mM磷酸磷酸缓冲液（pH7.8），现配现用，避光保存。（5）60mol/L核黄素（分子量376.36）：称2.25mg溶于50ml50mM磷酸磷酸缓冲液（pH7.8），现配现用，避光保存。（6）3mol/LEDTA-Na2（分子量372.24）：A、0.5mol/L：称9.306g溶于蒸馏水，定容至50ml。（注意：搅拌时用NaOH调pH至8.0才能完全溶解）。B、0.5mmol/L：取A液1ml用蒸馏水稀释定容至1000ml。C、3mol/L：取B液3ml用磷酸缓冲液稀释定容至500ml。,三、实验步骤,酶液提取：将经盐胁迫处理、称好保存的水稻叶片0.2-0.5g置于预冷的研钵中，加1-2ml预冷的SOD提取液在冰浴上研磨成浆，并转移到离心管中，再用提取液清洗研钵，每次1ml，转移到同一离心管中，终体积不超过4ml；于6000-8000rpm下离心5-10min，上清液即为SOD酶粗提液，置于冰箱保存备用。,2.反应体系,3.做预实验：在正式测定SOD活性之前，要进行酶液加入量的预实验，以确定最佳酶液浓度。酶液稀释：取其中一管酶液按1倍、10倍、100倍稀释。混合液配制：计算4-5支试管的用量，按反应体系表中各溶液(除酶液外)配制1份混合液(现用现配)。加酶液：在每支试管中加混合液2.95ml，再分别加入相对应的酶液量，其中2支空白对照用提取液代替酶液，混匀，马上用黑色塑料袋罩住。照光反应：取1支对照管于暗处，其余的置于试管架上，于4000Lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，光照时间视具体情况而定，如光照强、温度高则时间缩短，反之则延长，时间要严格控制）。终止反应：照光完毕马上用黑色塑料袋罩住试管架，以终止反应。SOD活性测定：以不照光的对照管做空白，分别测定各管OD值。确定酶液加入量：以抑制率在35%-65%为佳。,4.正式实验准备8支相同型号的试管：6支样品、2支对照。混合液配制：按8-10支试管的用量配制（同预实验）。加酶液：各管加入混合液2.95ml，6支分别加入相对应的酶液量，2支对照管用提取液代替，混匀，遮光。照光反应：取1支对照管置暗处，其余各管于4000Lx日光灯下反应，时间根据预实验进行调整（缩短或延长）。终止反应：照光完成后，迅速用黑色垃圾袋罩住试管架，终止反应。SOD活性测定：以不照光的对照管做空白调零，逐一迅速测定各管在560nm处的OD值。,四、结果计算,一个SOD酶活性单位的确定：按最初测定SOD活性时的设计，以能抑制反应50%的酶量为一个SOD酶活性单位。如NBT在光照下被还原为蓝色甲腙，检测OD560=0.5；若在反应系统中加入酶，SOD催化歧化为H2O2和O2，与NBT竞争，部分抑制了NBT还原成蓝甲腙的反应，检测OD560=0.25，NBT的光化还原刚被SOD抑制50%，则此时加入的酶量为一个SOD酶单位。,SOD总活性：以每克鲜重酶单位表示。SOD比活力：以酶单位mg蛋白表示。ACK：照光对照管的吸光度；AE：样品管的吸光度；V：样品液总体积（ml）；Vt：测定时样品用量（ml）；W：样品鲜重（g）；蛋白质浓度单位：mg蛋白g鲜重。,计算SOD活性：,五、注意事项,研磨样品时提取液要分次加入，用提取液洗研钵，并全部转移到离心管中，控制总量不要超过4ml。除正在研磨的样品外，其它余样品或提取好的粗酶液均保存在冰箱备用。混合液的配制、分装及加酶液的过程中