眼科学常见实验方法 PPT课件.ppt

,眼科学常见实验方法,眼科学常见实验方法,HE染色，视网膜血管ADP酶染色，视网膜血管FITC染色，免疫组织化学染色，尼氏染色RT-PCRwestern-blottunnel染色法elisa,HE染色,制作的全过程包括组织固定、取材、脱水、透明、浸蜡、包埋、修整蜡块、切片、贴片、烤片、去蜡、加水、苏木素染色、分化、水洗、返蓝、伊红染色、脱水、透明、封片等十多个步骤，每一步都必须仔细操作，即每一环节都必须高度重视，才能制作出高质量的染色切片，就每个环节应注意的问题阐述于下：,组织固定,（）组织固定固定一定要及时，组织离体内必须固定，且越新鲜固定越好，涂片、刷片、印片等尤其如此。配制固定液时，称药要准确，值调节要适当，固定液的选择与浓度的配制均要做好；固定液的用量以多于组织体积的倍为宜。盛固定液的容器，瓶口要大，以防人为的挤压。由于福尔马林的组织渗透力约为每小时，渗入组织的深度约为，故大标本要求正中先切开（如肝、脾）；肺则最好用支气管灌注福尔马林后再浸入固定液内、脑及眼球应用悬吊法固定。,取材脱水,（）取材大小，厚度不宜超过，取材整齐、平整、切成方形、圆形或矩形，不要切成三角形，要选取具有代表性的病变组织。内窥镜活检、诊断性刮宫等碎组织要用纱布包好，再用大头针扎紧后固定）脱水利用梯度酒精逐步脱水，适当掌握其浓度与脱水的时间。加温脱水可使组织固缩，以室温脱水为佳；只有脱水彻底，组织才能透明充分，才有利于石蜡的渗入。脱水剂要定期更换，组织块的周围脂肪组织不宜过多，否则将引起脱水不良，难以切片。,透明浸蜡,包埋,（）包埋石蜡包埋的温度可以比浸蜡的温度高，但动作要快，须将组织块放平整，尤其是两块以上的小组织或多块小组织应仔细地包埋成一条直线与包埋框横轴平行，这样既有利于防止病理医师诊断时不小心漏掉一块小组织同时也有利于完整地切片，形成蜡带；更要注意包埋面的解剖组织学关系，凡分层次的组织，层次表面应向下放平；皮肤可将表皮放在上端，应保证各层组织结构都能被观察到；如果包埋面的方向有错误，在镜下就无法观察到全层的组织结构，则必然会造成诊断上的困难。,修整蜡块切片,烤片脱蜡、水化，苏木素染色,盐酸分化,（）盐酸分化染苏木素后，除胞核着色外，胞浆，间质等也不同程度被染上了淡兰色。分化的目的是让应着色的细胞核更加清晰，使不应着色的部分，尽可能褪尽。分化的时间要看分化液的浓度，溶液的新旧，组织本身的特性，切片的厚薄及要求着色的深浅等因素酌情来定，最好是在显微镜观察下控制，一般分化数秒至。分化后的切片应立即入水中冲洗，让组织碱化，使胞核返兰。应注意的是：入水动作要轻；用细流水冲洗，请勿直接对着切片冲洗，以免脱片。碱化采用自来水或温水（），让其自然返兰并洗净残留的盐酸，有利于切片的长期保存。如果用碳酸锂，氨水等弱碱来返兰，切片则较易褪色。,伊红染色,（）伊红染色在每伊红染液内加滴冰醋酸可起到促染的作用。染色时间应依据伊红的配方及染液的新旧来灵活掌握。伊红有水溶性及酒精溶性两种，一般染。酒精伊红着色快，且颜色鲜艳。,脱水、透明、封片,（）完成了苏木素与伊红两种染料的染色，即染色，尚须用不同浓度的酒精彻底脱水，再用二甲苯充分透明后，方可用树胶封片。必须注意的是：载玻片与盖玻片均要求洁净。树胶要保持中性，其浓度要适当，量要适中，以防树胶溢出或封固不全。盖片周围多余的，溢出的中性树胶要擦净，盖玻片要放正。封片时盖玻片要稍大于组织块，以保证组织块已被全部封存在内。盖片时动作要轻，倾斜角度要适当，以免产生气泡。,制片注意,在制片过程中，注意在封片时，如果见切片呈云雾状，则说明酒精，二甲苯已陈旧，内已含有水份，应立即更换并重新脱水与透明。在整个制片过程中，不要让切片完全干燥，以防细胞固缩，组织龟裂，且影响折光率。封片以后，不要将切片置入温箱内，因加热可使树胶氧化，变为酸性，促使切片褪色。,病理切片的质量评估,视网膜血管ADP酶染色,2.1实验动物2.2标本处理2.3图像观察,2.1实验动物,健康成年猕猴3只,除一项眼前部的球结膜淋巴管形态实验外,未进行其他处理,灌注固定后取眼球。新鲜家猪眼球6只,新西兰大白兔眼球6只,毕格犬眼球4只,家猫眼球4只,SD大鼠、C57小鼠以及豚鼠的眼球各6只(每只动物只取1只眼)。,2.2标本处理,2.3图像观察,每一张铺片在同一拍摄参数情况下采集视盘旁、赤道部、周边部的图像各8张,3.视网膜血管FITC染色,当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的R氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合1520个，一个IgG分子可结合28个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S+N-H2-蛋白质FITC-NS-C-N-H2-蛋白质在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。,将纯化的IgG抗体对PH99.5碳酸盐缓冲液透析过夜，透析后抗体液移入小烧杯中称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC1mg/1mlDMSO)使终浓度为1mgFITC1mlDMSOFITCIgG比例:如IgG浓度为1mgml，FITCIgG比例约为50gFITCmgIgG；如IgG为510mgml，则比例为25gFITCmlIgG在10ml小烧杯中先放入抗体按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h用PD10柱(SephadexG25柱)除去游离荧光素，先用25mlPBS淋洗G25柱收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定FP比值。第二个荧光素峰为游离荧光素,操作步骤,计算:2.87A495FPA280-0.35A495合适的FP值为24。,试剂器材1.纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。2.FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。3.PBS、DMSO4.PH99.5碳酸盐缓冲液:Na2CO34.3g，NaHCO38.6g加蒸馏水至500ml。5.PD10柱(SephadexG25柱)6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等注意事项1.FITC保存于4暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。2.FITC-DMSO液要临用时配制。3.碳酸盐缓冲液要新鲜配制。,3.1Marsshall法,(1)材料抗体球蛋白溶液、05molL(pH90)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH72或30的001molLPBS等。(2)方法及步骤抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mgml，碳酸盐缓冲液容量为总量的110，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)510min。荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加001mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。a蛋白溶液：含量Amgm1；容积Bml。b总蛋白量(AXB)Crag。cC20C10Dmg(如蛋白含量低于20mgml，用C10；如高于20mgml，用C20)。d荧光素FITC的量：(1502100)XCEmg。e巳05molL(pH95)碳酸盐缓冲液D10Fml。fPBS量D-(B+F)=Gml。注：A为蛋白含量，mgml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。,结合(或标记)边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在510min内加完)，加完后，继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4冰箱中。透析结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500rmin)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH80缓冲盐水透析(04C)过夜。过柱取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：001molL磷酸盐缓冲液(pH72)；过滤量：12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析)；收集量：20ml(稀释17倍左右)。,3.2Chadwick法,(1)试剂和材料抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、001mol/LpH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯（25ml）搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）透析袋等。(2)方法及步骤抗体准备用o4C的pH8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为3040mgml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中。荧光色素准备按每毫克免疫球蛋白加入荧光素001rug计算，称取所需的荧光素，用3碳酸钠水溶液溶解。将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在o4C冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)1824h。透析和柱层析方法同Marsshall法。,3.3改良法,(1)试剂和材料001molL(pH72)PBS配法中，校定pH至72。NaCi18g、Na2HP04115g，溶于2000ml蒸馏水05molL(pH90)碳酸盐缓冲液配法取05molLNazCOs(53)10ml加入05molLNaHC03(42)90ml，混合后，校定pH至90。3碳酸钠水溶液配法称L5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。其他试剂和材料l叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。(2)方法及步骤取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(015molLNaCl)及缓冲液(05molLNaHC03Na2C03，pH90)稀释使每毫升内含蛋白质lOmg，缓冲液为总量的10，降温至4。加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素蛋白：荧光素(5080)mglmg，在04C下电磁搅拌1214h。然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。将制备好的荧光抗体加叠氮化钠o01，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4)可以用半年以上，一20C保存可达2年以上。,3.4透析标记法,此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。(1)试剂和材料试剂和材料同改良法。(2)方法及步骤用0025molL碳酸盐缓冲液pH90，将欲标记免疫球蛋白稀释成1浓度，装入透析袋中。用同一缓冲液将FITC配成01mgml的溶液，按10mgml球蛋白溶液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4C电磁搅拌下透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4中。,4.免疫组织化学染色,免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。如今,免疫组织化学染色技术已成为肿瘤病理诊断中最重要的辅助手段,但免疫组化染色过程中会出现各种各样问题,现将此过程中常出现的问题及解决方法分析如下。,免疫组化染色步骤,石蜡切片脱蜡至水;3%H2O2室温孵育510min;蒸馏水冲洗,PBS浸泡5min(如需采用抗原修复,可在此步后进行);5%10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭,室温孵育10min。倾去血清,不洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37孵育12h或4过夜;PBS冲洗,5min3次。滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释),37孵育1030min;PBS冲洗,5min3次;滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释),37孵育1030min;PBS冲洗,5min3次;显色剂显色(DAB或AEC);自来水充分冲洗,复染,封片。,注意事项,合适的抗体稀释度抗体浓度是免疫染色的关键。如果抗体浓度过高,抗体分子过多于抗原决定簇,可导致抗体结合减少,产生阴性结果。只有高稀释度时才能防止其非特异性背景染色。温育时间大部分为3060min,必要时4过夜。温育温度常用37,也可室温。应注意在湿盒中进行,防止切片干燥而导致失败。复染根据所用的染色方法和呈显颜色等不同情况选用适当的复染方法。如阳性结果呈红或棕色,则用苏木素将细胞核染成蓝色,以便定位检测,染色失败的几种原因,染色失败的几种原因所染的全部切片均为阴性结果,包括阳性对照在内。a.染色未严格按操作步骤进行;b.漏加一种抗体或抗体失效;c.缓冲液内含叠氮化钠,抑制了酶的活性;d.底物中所加H2O2量少或失效;e.复染或脱水剂使用不当。所有切片呈弱阳性反应:a.切片在染色过程中抗体过浓,或干燥了;b.缓冲液配制中未加氯化钠和PH不准确,洗涤不彻底;c.使用已变色的呈色底物溶液或呈色反应时间过长;d.抗体温育时间过长;e.H2O2浓度过高,呈色速度过快;f.粘附剂过厚。所有切片背景过深:a.未用酶消化处理切片;b.切片或涂片过厚;c.漂洗不够;d.底物呈色反应过久;e.蛋白质封闭不够或所用血清溶血;f.使用全血清抗体稀释不够。阳性对照染色良好,检测的阳性标本呈阴性反应。固定和处理不当是最常见的原因,5.尼氏染色,尼氏(稀551)染色法具有简便、快捷的特点,是中枢神经核团定位、细胞计数等形态学研究经常采用的一种染色方法。本实验选用大鼠50只,先将视神经切断,再移植坐骨神经段至眼玻璃体内。动物分别存活2、8周后,取眼球在2%多聚甲醛液中迅速剥离视网膜进行固定、脱水、透明、石蜡包埋、切片、Nissl染色。光镜观察视网膜节细胞(RGC)形态,并用计算机图像分析仪侧量RGC胞体截面积。可见RGC胞体轮廓清晰(图1,2),可容易地测出其截面积,对于RGC的再生规律提供了形态学依据。现将在方法上需注意的几个问题介绍如下。,5.1组织固定,手术显微镜下取动物眼球,浸泡于2%多聚甲醛液中(0.1mol/LpB,pH7.魂),剥离视网膜,并在此液中固定1小时。结果组织完整,胞体内尼氏小体清晰。我们曾采用心脏灌流固定后取材的步骤,虽细胞状态尚好,但固定后组织较硬,使剥离视网膜的完整性受到严重影响。我们还尝试了眼球整切,结果视网膜与眼球壁的其它层膜会自然分离,使切片杂乱,位置关系也易改变。因此取材后组织局部固定,方法较简便,效果好。,5.2.浸蜡包埋,脱水、透明时间的掌握是本实验的关键。由于视网膜较薄,所以在100%酒精中不超过1小时,二甲苯中以3040分钟为宜。在浸蜡时组织有一定卷曲,为了保证每张切片上组织的连续性,一定要使组织的方向与所需方位保持一致,最好在取材时加以矫正。一旦成形后,切不可挤压牵拉,以免影响细胞形态造成假象。,5.3染色,脱蜡后的切片入0.05%CresylVioet溶液中,置温箱20、30分钟,70%酒精分色,结果胞体中尼氏小体呈深紫色,背地清晰。我们认为。.05%的染液较0.1%的染液在染色和分色时间上容易控制。为避免染色深浅不均,侧量时造成误差,影响统计结果,所以在染色和分色时间上一定要通过反复实践方可掌握。为使细胞形态更接近活体时的形态,染色要一次完成,避免反复染色和分色。,6.RT-PCR,1.从细胞或特定组织中提取总RNA；2.逆转录实验；3.扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。,6.1从细胞或特定组织中提取总RNA6.1.1RNA提取（-80保存）,取50-100mg组织加入1mlTrizol，剪碎，振荡30s转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min12000rpm4离心15min转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min12000rpm4离心15min倒掉上清，加1ml75%无水乙醇（4保存），振荡混合，7500rpm4离心5min倒掉上清，室温或37放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥加20ulDEPC水至EP管中在50孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解注意：操作过程中带手套口罩，所用到的仪器设备须经去除RNA酶处理（灭菌或DEPC水浸泡）,6.1.2测RNA浓度（以750ul体系为例）,调零：750ulDEPC水测量：745ulDEPC水+5ulRNA总RNA浓度=OD26040稀释倍数（150倍）ug/ml=OD26040150ug/ml=OD2606ug/ulA260/A280应在1.8-2.0之间,6.2逆转录实验以通用试剂盒为例，反应体系20ul,1.RNA短暂离心2.RNA模板0.5-2ug,再加入Oligo(dt)1ul,加DEPC水补齐至10ul.轻轻混合均匀，短时间离心3.将反应液置于655min冰上1min,短时间离心,4.按顺序加入：5buffer4ul200ul核糖核苷酸酶抑制剂0.5ul10mmdNTPMIX1ul逆转录酶1ulRNase-freeH2O3.5ul轻轻混合均匀，5.短时间离心将混合物置于37，60min6.75加热15min,中止上述反应，置于冰上,注意事项RNA提取和逆转录时所用器具均应在1DECP水中避光浸泡过夜，再高压烘干DECP水配制（先加DEPC，再加水，避光过夜，然后高压）3.75%无水乙醇配制（DEPC水：无水乙醇=1:3）4.RNA提取和逆转录时应全程佩戴一次性手套和口罩,6.3扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。聚合酶链反应PCR(产物-20保存),125ul的反应体系，冰上操作，稍后短时间离心Template1ul/3ulPrimer11ulPrimer21ul10*TaqBuffer5uldNTPs(10mM)1ulTaq酶1ulddH2O补至25ul(9.5ul/7.5ul),2.PCR循环:945min9445sTm+445s7245s229-34(从第2步开始循环30-35个循环)7210min412hPCR结束后-20保存或置于冰上开始电泳。退火温度计算2（AT）4（GC）正反义平均数，再上下波动度（4，或5）引物稀释方法引物先离心，后用DEPC水或双蒸水稀释成10倍母液再取5ul母液，加45ulDEPC水或双蒸水稀释10倍成操作液,7.western-blot,蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即WesternBlot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。,7.1试剂准备,1、SDS-PAGE试剂：见电泳实验。2、匀浆缓冲液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.0ml；10%SDS6.0ml；-巯基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。3、转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4、0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。5、膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。6、显色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H2021.0l。样品制备,7.2样品制备7.2.1单层贴壁细胞总蛋白的提取：,（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。（2）每瓶细胞加3ml4预冷的PBS（0.01MpH7.27.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。（3）按1ml裂解液加10lPMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）（4）每瓶细胞加400l含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中（整个操作尽量在冰上进行）。（6）于4下12000rpm离心5min（提前开离心机预冷）。（7）将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于20保存。,7.2.2组织中总蛋白的提取：,（1）将少量组织块置于12ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。（2）加400L单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。（3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。（4）裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于20保存。,7.2.3加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：,由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：（1）将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。（2）弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。（3）用枪洗干上清后，加100L裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。（4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于20保存。,7.3含量测定7.3.1、制作标准曲线,（1）从20取出1mg/mlBSA，室温融化后，备用。（2）取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0g，2.5g，5.0g，10.0g，20.0g，40.0g。（3）按下表在各管中加入各种试剂。4）混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（BioPhotometer，Eppentoff）上比色分析。,7.3.2检测样品蛋白含量,（1）取足量的1.5ml离心管，每管加入4储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。（2）取一管考马斯亮蓝加0.15mol/LNaCl溶液100ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。（3）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5mL），再用无菌水洗一次。（4）取一管考马斯亮蓝加95ml0.15mol/LNaClNaCl溶液和5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5ml样品含的蛋白量。,7.4免疫反应,1、将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。2、将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育12h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。3、同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，重复步骤（2）中最后一步，进行化学发光反应。,7.5化学发光,1、将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。2、在暗室中，将1显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为12min（2025），温度过低时（低于16）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为510min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。,7.6凝胶图象分析,将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。,8.Tunnel染色法,一相关试剂：酶缓冲液：vial1:EnzymeSolution标记液：vial2:LabelSolution固定液：4%多聚甲醛（PBS配制，现配）清理液：PBS（pH7.4）透性处理液（Permeabilisationsolution）：含0.1%TritonX100的0.1%柠檬酸钠（100ml溶液中含0.1g柠檬酸钠）的缓冲液，新鲜配制二其他设备：湿盒荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal）,三染色步骤,标本预处理：（1）、适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，目标细胞，PBS洗一次，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；（用组化笔圈住细胞，并用mark笔在玻片反面做标记）（2）、将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛中固定25min（4过夜）；（3）、PBS（200ul）清洗二次，每次5min；（4）、将吸附细胞的载玻片在0.2%的TritonX-100（0.1%TritonX100的0.1%柠檬酸钠）中处理5min；（先固定细胞再用Dnase1处理细胞做阳参）,TUNEL反应液：从标记液（vial2:LabelSolution）中吸出100ul用于2个阴性对照（50ul/个）；将50ul酶缓冲液（vial1:EnzymeSolution）加入到剩余450ul的标记液中充分混合均匀，得到500ulTUNEL反应液（50ul/样本，检测10个样本）。标记：（1）PBS（200ul）清洗样品3min，3次；（2）吸干样品周围的液体；（3）往样品上滴加TUNEL反应液（覆盖整个样品），阴性对照加标记液；（4）湿盒