专题复习——PCR技术.ppt

PCR技术,高考专题复习,多聚酶链式反应（PolymeraseChainReaction），是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。,1988年美国穆里斯（K.Mullis）等人发明，荣获1993年诺贝尔化学奖。,PCR,【基础知识】,一、PCR原理：,DNA复制：,半保留复制；,【基础知识】,一、PCR原理：,DNA复制：,半保留复制；,需要提供合成模板；不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3-OH；合成的方向都是53。,DNA聚合酶,【基础知识】,一、PCR原理：,DNA复制：,半保留复制；,DNA的热变性原理。,TaqDNA聚合酶,耐高温。,【基础知识】,二、PCR条件：,胞内DNA复制与PCR技术的比较：,变性,TaqDNA聚合酶,DNA母链,dNTP,3个温度,Mg2+,缓冲对,连续复制,DNA,【基础知识】,二、PCR条件：,引物：,利用软件设计。,引物设计的原则：,决定PCR扩增产物的特异性和长度。,1.引物长度：,通常为2030bp，尽量降低引物与非扩增区的同源性；,2.引物内部不能存在部分互补序列；,3.两个引物之间不能存在部分互补序列；,4.引物的5端可以修饰，但3端不可以修饰：,如探针标记。,例题1,【2011年安徽】家蚕细胞具有高效表达外源基因能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以提取干扰素用于制药。采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液（含Mg2+）、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、和。,对干扰素基因特异的DNA引物对,TaqDNA聚合酶,例题2,【2011年江苏】请回答基因工程方面的有关问题：（1）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。,第一组：；第二组：。,引物和引物局部发生碱基互补配对而失效,引物自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效,（2）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为。,DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上,【基础知识】,二、PCR条件：,温度：,7075：,9095：,5560：,变性；,复性；,延伸。,【注意】,具体温度与DNA母链及引物中的G、C含量有关。,例题3,【2008年江苏】回答下列问题。（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是。（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？。,耐高温,引物对B,【基础知识】,三、PCR过程：,预变性；,复性；,延伸；,循环。,变性；,【2011年江苏】利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。（1）从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为。（2）在第轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。,15/16,三,例题4,【实验操作】,一、实验仪器：,二、设置对照：,【实验操作】,三、程序设计：,避免外源DNA的污染。,【实验操作】,微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；,微量离心管在每吸取一种试剂都必须更换枪头；,所有的成分加入离心管后，盖严盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，离心10s，使反应液集中在离心管底部，再放