登革热实验室检测.ppt

登革热实验室诊断技术及评价,病毒病预防控制所李建东,内容概述,检测指标及动态变化检测策略抗原检测病毒分离核酸检测抗体检测常用检测试剂比较,登革病毒实验室检测指标,诊断标记,RT-PCR,NS1：膜相关NS1，mNS1分泌型NS1，sNS1发病第1-9天出现病毒血症期必然出现的分子标识物可高达50g/mL,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,登革病毒首次感染,PLoSNeglTropDis5(9):e1309.,登革病毒再次感染,PLoSNeglTropDis5(9):e1309.,合适的时机采用合适的检测方法,世界卫生组织登革防控指南2009,登革实验室检测方法特点及费用,世界卫生组织登革防控指南2009,登革实验室检测方法优缺点,世界卫生组织登革防控指南2009,早期检测宜用PCR、NS1，发病5天后宜采用抗体检测,KappacoefficientPCR=0.72NS1ELISA=0.81NS1Rapid=0.77,不同检测方法的精确性,NS1抗原检测,3种商业化检测试剂盒PanBio（Inverness)-ELISA&LateralflowRapidtest（strip）Platelia（BioRad)-ELISA&LateralflowRapidtest（strip）SDBioline-Cassette万泰？,阴性检测结果不能排除近期感染孕妇和携带类风湿因子的患者常可出现假阳性结果,适用于多种标本,临床标本急性期全血、血清或血浆，脑脊液（0-5天）4-8保存不超过2天长时间保存-70以下或干冰尸检组织标本应立即保存于-70以下或干冰,疫情暴发地区的蚊虫媒介,适用于所有血清型，首次感染更敏感,尸检组织标本的NS1抗原检测,PLoSNeglTropDis2011,5:e1147,蚊媒标本中NS1抗原检测,Labinfectedmosquitoes:95.8%,Fieldcaughtmosquitoes:,PCR,污染问题：敏感性增加，污染风险加大，套式PCR增加污染风险，实时定量RT-PCR污染风险降低，阴性对照为阴性不能排除污染的风险。防RNA酶内对照、定量分析特异性敏感性主要取决于引物、探针,核酸检测流程图,反应体系混合物正、反向引物混合物特异性荧光探针,1)核酸分离,2)Real-timePCR检测,20l,5l,反应条件取决于病原体特异性,PCR仪,合适的PCR管,病毒分离,敏感性,病毒分离的流程,蚊媒匀浆或血清；加入细胞培养管或瓶；37吸附1小时，每15分钟轻轻摇动一次；补液；33孵育3-7天，每日或隔日观察CPE；IFA检测，传代，IFA检测。单抗检测分型。,病毒分离影响因素：标本采集、保存和运输，分离方法，病毒型别、载量，患者免疫反应等,检测抗体,中和实验通过将血清与病毒混合，接种微量板内单层细胞，检测抗体对病毒感染性的影响。检出中和抗体可确定存在登革病毒保护性免疫。是唯一分型检测IgG抗体的方法。微量中和实验,登革病毒首次与再感染特异性抗体动态变化,检测抗体,血凝抑制实验免疫荧光法酶联免疫法：间接法、抗体捕获法、抗原捕获法,间接法,抗体捕获法,抗原捕获法,7种ELISA检测方法的精确性和敏感性比较,6种检测试剂的特性及交叉反应,6种检测试剂的精确性和敏感性,实验室检测结果解释,世界卫生组织登革防控指南2009,登革热诊断标准WS216-2008,单一标本的IgM抗体检测结果不能作为确诊依据。双份血清（间隔7-14天）抗体阳转，抗体滴度4倍或以上升高可以确诊（WHO）IgM抗体阳性提示急性或近期感染（通常90天），但单一标本的IgM抗体检测阳性结果不能确诊阴性结果不能排除登革病毒感染类风湿因子等存在是可发生交叉反应，也可与其他黄病毒发生交叉反应20-30%继发感染病例，检测不到IgM抗体。,确诊：,首次感染与再感染辨别,DengueIgGcaptureELISA,新检测试剂盒,AssureDengueIgASDBiolineDuo：NS1-IgM-I