免疫组织化学技术ppt课件

.,免疫组织化学技术,.,免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测的技术。,.,基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。,.,免疫组化的特点特异性强敏感性高定位准确、形态与功能相结合,.,免疫组化的作用,凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示。,.,实验所用标本,石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究。,.,实验设备,恒温冰冻切片机、脱水机、石蜡包埋机、切片机、摊片机、烤片机、冰箱、电磁炉、高压锅、染色架以及离心机和免疫组化试剂等,.,.,.,脱水机、石蜡包埋机,.,免疫组化技术分类,1、免疫荧光方法2、免疫酶标方法3、免疫胶体金技术4、免疫铁蛋白法5、放射免疫自显影法,.,酶联免疫组织化学,ABC法S-P法,.,免疫组化操作步骤,.,一.石蜡切片制作,1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精（）、（）各2h3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（）、（）各30min4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58）45min，石蜡（）、（）、（）共2.5h，用石蜡（）包埋组织,.,5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7m，的石蜡带6、贴片：将组织石蜡块在50温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上（洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干涂胶：防脱剂多聚赖氨酸）7、烤片：68恒温箱内烤片2h,.,二.SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结）三步法染色步骤,1、脱蜡、水化6020分钟二甲苯210分钟100%的绝对乙醇:25分钟;95%ethanol2minutes；95%的乙醇2分钟80%ethanol2minutes；70%ethanol2minutes；distilledwater:5min；蒸馏水:5分钟PBS洗3次3min。,.,2、阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性3、PBS冲洗2-3次，每次5min4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温5、PBS冲洗2-3次，每次5min6、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体7、滴加抗50l，室温静置1h，或者371h，或者4过夜（需在37复温45min）8、PBS冲洗2-3次，每次5min,.,9、滴加辣根过氧化物酶标记的抗4050l，室温静置1h，或371h10、PBS冲洗2-3次，每次5min11、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37孵育30min-1h12、PBS冲洗2-3次，每次5min13、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）（A：DABB：H2O2C：磷酸缓冲液）,.,14、自来水冲洗10分钟终止反应15、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化16、自来水冲洗10-15min17、常规脱水50%ethanol1-2min，70%ethanol1-2min95%ethanol1-2min；95%ethanol1-2min；100%absoluteethanol:(1-2)min。透明：Xylene1(1-2)minXylene2(1-2)min封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检,.,三.二步法免疫组化染色步骤,二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯PBS冲洗3次，每次3分钟根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性PBS冲洗、浸泡5分钟，3次正常山羊血清室温封闭10分钟,.,甩去血清，加入适当稀释的一抗，37孵育60分钟或4过夜PBS冲洗，浸泡5分钟，3次滴加多聚螯合物，37孵育30分钟PBS冲洗，浸泡5分钟，3次新鲜配置酶底物显色液DAB显色310分钟流水冲洗苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜观察拍照IPP软件分析光密度,.,几种抗原修复方法,真空负压抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇真空负压处理5分钟。自来水洗，蒸馏水洗。0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），真空负压干燥箱预先调至95，真空负压处理10分钟。待修复注降至室温的一，PBS洗3次，随后按选好的免疫组化染色方法进行染色。,.,微波辐射抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分钟左右。待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。,.,高压抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续14分钟。待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。,.,电炉加热抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92后，即可拔离电源，当温度低于92时，再插上电源，如此反复持续至10分钟左右。待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。,.,胰蛋白酶消化法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。PBS洗3次，1分钟/次。滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20分钟左右。PBS洗3次，2分钟/次。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。,.,所用试剂,1.PBS：0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制-取NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO412H2O3.63g或Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用2.包埋剂：石蜡3.防脱剂：多聚赖氨酸（PLL5g+蒸馏水1000ml）、APES（3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）,.,4.固定液：4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制a.0.1M磷酸盐缓冲液：取A液400ml与B液80ml混合后，调pH于7.4，再定容至500mlA液：0.1mol/LNa2HPO4（Na2HPO412H2O35.8g加水定容至1000ml）B液：0.1mol/LNaH2PO4（NaH2PO42H2O15.6g加水定容至1000ml）b.4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液：取20g多聚甲醛溶于500ml0.1M磷酸盐缓冲液中，加热并搅拌约2-3h后溶解5.细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%TritonX-100（曲拉通X-100又称清洁剂）混合而成。配制方法是先用微波加热的36mlPBS，再接着加120ulTritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4ml30H2O2。,.,6.抗原修复液：0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0），或0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）配制-取A液8ml与B液42ml混合后加水至400ml，调pH于6.0，再定容至500mlA液：0.1mol/L柠檬酸（C6H8O7H2O21.01g加水定容至1000ml）B液：0.1mol/L柠檬酸钠（Na3C6H5O72H2O29.41g加水定容至1000ml）7.5羊血清或封闭血清，用PBS稀释。含0.03H2O2的0.05DAB二氨基联苯胺（避光）：用20DAB（1，10mg/ml）5ul0.1ul30%H2O295ulPBS。8.一抗（特异结合底物1:100）、二抗均用PBS稀释。9.二甲苯、梯度酒精（1002、95、80、70、50）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。10.显色剂：DAB试剂盒、苏木素染液,.,免疫组化结果的判断原则,1、每批染色都要有特异性阳性对照和阴性对照为基础，才能对染色结果做判断；2、阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性；3、阴性结果不能视为抗原不表达，即阴性结果无判断意义；阳性结果有强弱、多少之分，哪怕一个细胞阳性，只要是在抗原所表达部位，也有诊断意义。4、当免疫组化结果与HE切片诊断有矛盾时，以HE切片诊断为准。5、应用“反正法”确保免疫组化在诊断中的准确性。6、避免假阴性和假阳性的发生。,.,免疫组化的应用范围,在常规病理诊断中应用免疫组化主要有8个方面：1、对肿瘤的组织起源进行鉴别诊断；2、对肿瘤的良恶性进行综合判断；3、发现微小转移灶；4、激素受体的检测以指导临床治疗；5、激素类细胞的定性和定位，以明确内分泌细胞的类型和功能状态。6、指导肿瘤预后，如PgP、CerbB-2、P53等。7、指导肿瘤分期；8、免疫性疾病的辅助诊断，如肾小球肾炎、某些皮肤疾病等组织内免疫复合物的检测。,.,免疫组化染色中的常见问题及对策,免疫组化操作方法比较简单，然而在实际工作中也会遇到一些麻烦，如脱片、无特异性表达或表达较弱、染色过强、背景染色强、定位不好等。引起上述问题的原因较多，主要有组织固定、脱水不良或浸蜡温度过高导致抗原丢失；抗原未修复；抗体或工作液失效、抗体稀释不当；在一定温度下抗原孵育时间不足、一抗和二抗不匹配；显色剂失效或配置方法失误等。因此，良好的组织固定和脱水及适当的浸蜡温度是做好免疫组化的前提。中性福尔马林固定有利于正确结果的显示。,.,1、脱片的可能原因与对策,整批切片脱片可能是载玻片未处理，玻片上有油污未清洗或未涂抹防脱片胶，或烤片时间不足致粘片不牢固。单张切片及整块组织脱片除了上述原因外，需考虑抗体热修复时液体温度过高和时间过长，或冲洗时用力过猛等因素。,.,2、无特异性表达的原因,问题确认染色过程次序是否正确；是否忽略了某一过程；是否孵育了足够的时间；是否使用了正确的抗体，以及二抗是否和一抗一致匹配。底物显色系统是否失效。,解决方法重新实验，设立阳性对照，以验证实验结果；仔细确定一抗与二抗种属；更换显色剂（DAB或AEC）;不得使用过期试剂盒，不同批号试剂盒不能混用；,.,3、表达较弱,问题标本固定方式不当或固定时温度过高，使部分组织抗原被破坏；抗原修复方式不当；抗体浓度过低，或者孵育的温度、时间不够；冲洗后切片残留多余缓冲液。如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，应考虑查标本本身原因。,解决方法新鲜组织及时固定，防止自溶，固定时间不超过24小时；封闭时间不超过10分钟，或参考产品说明；注意复染时间提高抗体浓度，孵育时间不少于60分钟（室温低于15，改在37温箱孵育或4冰箱过夜）,.,4、染色过强,问题抗体浓度过高或孵育时间过长孵育温度过高，37显色速度过快或显色时间过长；,解决方法降低抗体浓度、孵育时间；室温1小时或4过夜；缩短显色时间；显色时间不超过510分钟，以显微镜下观察为准；,.,5、非特异性背景染色,问题操作过程中冲洗不充分；加试剂后切片干燥；组织切片折叠；组织中含过氧化物酶未阻断；组织中含内源性生物素；组织抗原弥散；切片粘附剂过厚；血清蛋白封闭不充分；,解决方法每步冲洗35；防止切片干燥（必要时重做）勿以折叠处观察染色结果；可配置新鲜3%双氧水封闭，孵育时间延长；正常非免疫动物血清再封闭；组织及时固定，固定液要合标准重新配置粘附剂涂液；延长血清封闭时间；,.,6、染色定位不好,除涉及抗体因素外，应注意标本本身的前期处理及具体的操作方法等。,.,7、封片时的注意事项,封片时动作快切片入二甲苯后起白雾，为脱水未尽记住切片的组织面防脱片处理盖片必须大于组织块封固剂不要滴得太多，也不要太少，防止气泡产生。,.,注意事项,一、抗体的保存浓缩抗体：有效期内，只需放在4冰箱内，保存时间可达1-3年。即用型抗体：理论上在4冰箱内可保存半年左右。PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可放置1-2个月。,.,二、出现