4高效液相色谱法（课件）.ppt

高效液相色谱法,HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC,主要内容,概述基本理论高效液相的种类高效液相色谱分离方法高效液相色谱仪5高效液相色谱应用,3,一、概述特点,高压-150350 x105Pa,高速-小于1h,高效-3万塔板/米（气相色谱2000塔板/米）,高灵敏度-10-910-11g,概述,高效液相色谱法与经典液相色谱法,经典液相柱色谱装置,高效液相色谱仪,例：分离20种氨基酸,柱长：170cm柱径：0.9cmF：30mL/ht分离:20h,经典柱色谱,HPLC,t分离：1h,分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测，占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%,2、HPLC与GC差别,2流动相差别的区别GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。3操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,2、HPLC与GC差别,3、速率方程,溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一,A涡流扩散项B/u分子扩散项Cu传质阻力项,流动相流速对板高的影响,小颗粒填料，填充均匀；选择较低的流动相流速；选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。,修正的速率方程：,提高柱效途径,高效液相色谱仪,WatersUPLC超高效液相色谱仪,一、液一液分配色谱法（LLPC）在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体.它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。,第二节HPLC的主要类型,1分离原理液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。,液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：（1）全多孔型载体：早期由硅胶、硅藻土等材料制成，直径约100m的全多孔型颗粒。70年代，用了直径小于10m载体，是由nm级别的硅胶球堆积而成，这类固定相由于颗粒很细，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。,2.固定相,（2）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）：由直径为3040m的实心玻璃球和厚度约为12m的多孔性外层所组成。目前，这种载体粒度为510m。,这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。,化学键合固定相：它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。,当流动相(s)通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附:X+nSad=Xad+nS,1分离原理,二、液一固吸附色谱法(LSAC),达平衡时,有,其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。用途：分离中等分子量的油溶性试样，对具有不同官能团和异构体有较高选择性。凡能用薄层色谱法分离的都可以用液固色谱法。,液固吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。目前最广泛使用的还是510m的全多孔型微粒填料。,2固定相,一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。,3.流动相,离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。原理：离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。,三、离子对色谱法（IPC）,由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性固定相（有机相）提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对流水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。这就是离子对色谱法分离的基本原理。A-+B+（流动相）-A-B+（固定相）,流动相：加有平衡离子（反离子）的极性溶液通过改变流动相的pH、平衡离子的浓度和种类可改变分离的选择性。,固定相：非极性的疏水键合相,凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。,四、离子交换色谱法（IEC）,离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：,1离子交换原理,阳离子交换：,阴离子交换：,一般形式：R一ABRBA,达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：,式中Ar，Br分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，A、B则代表它们在溶液中的浓度。KB/A越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。,2.固定相,（1）薄膜型离子交换树脂它是在直径约对30m的固体惰性核上，凝聚12m厚的树脂层。,（2）离子交换键合固定相它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。,离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。,3.流动相,抑制型：抑制柱型、连续抑制型分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.010.05毫摩尔/克干树脂,五、离子色谱法（IC）,非抑制型:当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.0070.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。,离子色谱装置类型,离子色谱连续抑制装置图：,通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：,R+OHH+Cl-R+Cl十H2OR+一OH-M+Cl-M+OHR+Cl-,由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的浓度为Cl-离子的26倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。,主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。,六、空间排阻色谱法（SEC）,空间排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。,分离原理,排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。,固定相,保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器。固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10才能得以分离。,4.特点：,液相色谱分离类型选择参考表,x,x,x,x,A,B,D,A,主要内容,概述基本理论高效液相的种类高效液相色谱结构4高效液相色谱应用,高压泵,流动相溶剂,废液,色谱柱,进样口,检测器,高压输液系统+进样系统+分离系统+检测系统,1、贮液器和吸滤器：,一、高压输液系统,贮液器:1-2L的玻璃瓶,溶剂吸滤器:Ni合金，孔约0.45m，防止颗粒物进行泵内。,一、高压输液系统,1.高压泵,要求：输出压力高平稳、脉冲小流量稳定可调耐腐蚀,LC最重要的部件,2.梯度洗脱装置,低压梯度（外梯度）,高压梯度（内梯度）,通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。,梯度洗脱,改善分离缩短分离时间,泵增压混合,混合泵输入,按比例,等度洗脱与梯度洗脱,梯度洗脱的特点,改善分离,加快分析速度；改善峰形,减少拖尾;可能引起基线漂移,3.贮液瓶及流动相,1)对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2)适用于所选择的检测器。3)化学惰性好，以免破坏固定相。4)低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5)纯度高，溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。,对流动相溶剂的一般要求,二、进样系统,准备状态进样状态,六通阀进样装置,自动进样器,直接进样进样阀自动进样器,三、色谱柱,分离柱,色谱仪心脏,三、色谱柱,柱长1530cm，内径45mm,基质(硅胶或高分子聚合物微球),功能层(固定在基质表面对样品分子保留起实质作用的有机分子或功能团),；40000-70000plates/meter,四、化学键合相色谱,采用化学键合相的液相色谱,固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。,特点,分配色谱：液液色谱+键合色谱,基质：又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球。,利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面。这种化学键合型固定相是当今HPLC最常用的固定相，大约占HPLC固定相的四分之三。特点：不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱,2.键合固定相,1.键合固定相制备,ODS(C18)键合相,硅胶,十八烷基氯硅烷,非极性,硅烷化反应,使用pH范围：28,正相分配色谱,组分极性越大，保留时间越长,反相分配色谱,组分极性越小，保留时间越长,分离强极性物,流动相的要求：1、对样品有一定的溶解度。2、适用于所选的检测器。3、化学惰性、4、安全性、5、低粘度、6、高纯度。,表示溶剂的体积百分比，P表示溶剂的极性大小。,reversedphaseHPLC由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。1）固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（ODS柱）2）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性固定相极性底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水+甲醇，乙腈，,3.反相HPLC,3）流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR4）出柱顺序：极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱5）适用非极性中等极性组分（HPLC80%问题）当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。,normalphaseHPLC由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。吸附色谱也属正相HPLC，早期的液相色谱中曾广泛采用这种体系。1）固定相极性大的氰基或氨基键合相2）流动相：极性小底剂+有机极性调节剂例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇3）流动相极性与k的关系流动相极性，洗脱能力，组分tR，k,4.正相HPLC,4）出柱顺序结构相近组分，极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱。5）适用分析极性大物质、如糖类等。对于一些在非极性疏水固定相中强烈保留的有机分子常常采用正相HPLC模式。,非键合相表面键合相表面ODCC18C8C1Phenyl-NH2-CN,HPLC的固定相的化学构造,62,正相色谱与反向色谱的不同特性,D,A,B,B,C,13、高效液相色谱法的分离效能比经典液相色谱法高，主要原因是()A、载液种类多B、操作仪器化C、采用高效固定相D、采用高灵敏度检测器5、采用反相分配色谱法()A、适于分离极性大的样品B、适于分离极性小的样品C、极性小的组分先流出色谱柱D、极性小的组分后流出色谱柱16、采用正相分配色谱()A、流动相极性应小于固定相极性B、适于分离极性小的组分C、极性大的组分先出峰D、极性小的组分后出峰,C,D,A,22、正己烷、正己醇和苯在正相色谱中的洗脱顺序依次为（）A、正己烷先流出，然后是正己醇，苯最后流出B、正己醇先流出，然后是正己烷，苯最后流出C、正己烷先流出，然后是苯，正己醇最后流出D、正己醇先流出，然后是苯，正己烷最后流出23、正己烷、正己醇和苯在反相色谱中的洗脱顺序依次为（）A、正己烷先流出，然后是正己醇，苯最后流出B、正己醇先流出，然后是正己烷，苯最后流出C、正己烷先流出，然后是苯，正己醇最后流出D、正己醇先流出，然后是苯，正己烷最后流出,C,D,10、在分配色谱法中，若被分离物质极性大，应选择极性大的固定液、极性小的流动相。（）11、在液-液色谱分析中，分离极性物质时，应选用正相色谱，此时固定相的极性大，流动相的极性小。（）12、在液-液分配色谱中，若分离非极性组分，则选择极性固定液、非极性流动相。此色谱又叫正相色谱。（）14、高效液相色谱法中常采用程序升温来提高分离效能、改善峰形和降低检测限。（）15、高效液相色谱中的梯度洗脱装置的作用是可以将两种或两种以上不同性质但可互溶的溶剂，按一定的程序连续其组成，从而改变被测组分的相对保留值，提高分离效率，缩短分析时间。（）17、高效液相色谱法广泛使用的固定相为化学键合固定相，它是用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上而形成的。（）,数据处理系统：又称色谱工作站。它可对分析全过程（分析条件、仪器状态、分析状态）进行在线显示，自动采集、处理和储存分析数据。自动控制单元：将各部件与控制单元连接起来，在计算机上通过色谱软件将指令传给控制单元，对整个分析实现自动控制，从而使整个分析过程全自动化。,六、数据处理系统与自动控制单元,四、检测系统,1.紫外吸收检测器(ultravioletphotometricdetector),(b)可变波长紫外检测器,(c)二极管阵列检测器,通用型选择型,聚焦,二极管阵列检测器,diode-arraydetector,DAD以光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器,它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。,两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器,(b),(a),77,灵敏度高，精密度及线性范围较好，可用于梯度洗脱、色谱峰的识别和纯度分析。不能分析紫外没有吸收的化合物。流动相选择有限制。,一些常用溶剂的紫外截止波长,紫外检测器特点,fluorescencedetector原理：许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。,二、荧光检测器,特点：有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2-3个数量级。所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析。,differentialrefractometers,RI原理：基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。示差折光检测法也称折射指数检测法。,三、示差折光检测器,绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以RI是一种通用的检测方法。虽然其灵敏度比其他检测方法相比要低1-3个数量级。对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。,原理:色谱柱流出液进入雾化器形成微小液滴，与通入的气体(通常是氮气，有时也用空气)混合均匀，经过加热的漂移管，蒸发除去流动相，样品组分形成气溶胶，用强光或激光照射气溶胶，产生光散射，用光电二极管检测散射光。散射光的强度(I)与组分的质量(m)有下述关系：I=kmb或lgI=blgm+lgk其中k和b为与蒸发室(漂移管)温度、雾化气体压力及流动相性质等实验条件有关的常数。,83,6:蒸发光散射检测器(ELSD),商品化的ELSD都是三部分组成，即雾化器、加热漂移管和光散射池。a:雾化器与分析柱出口直接相连，柱洗脱液进入雾化器针管，在针的末端，脱洗液和充入的气体（通常为氮气）混合形成均匀的微小液滴，可