免疫亲和纯化和免疫沉淀.ppt

免疫亲和纯化和免疫沉淀技术，泸州医学院免疫学和刘家佳20010年4月，亲和层析和沉淀的使用，亲和层析和沉淀被认为是酶和蛋白质分离纯化的强大技术手段。该方法可以比较经济地使用配体，可以大规模、快速、特异性地分离降解、纯化酶和蛋白质。蛋白质的功能，蛋白质(酶)存在于所有生物体中，是非常重要的生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者，负责生物催化、物质运输、运动、防御、调节和记忆、识别等多种生理功能。蛋白质分离和纯化，蛋白质分离和纯化是利用仿生下游技术从混合物中分离和纯化所需目的蛋白的方法。蛋白质分离及纯化技术是现代生物产业和生命科学研究的核心技术。这项技术难度大，成本高。例如，一种生物药物成本的75%花在下游蛋白质分离和纯化上。生物工程上游技术：包括理论研究、技术开发等：基因工程、蛋白质结构和功能研究。生物工程下游技术：一般产品(通常是蛋白质)的预处理、分离和纯化；在产品的成型加工和质量监控等一系列单位操作和工艺的主要技术中，生化产品和发酵产品的分离和精制是核心内容。下游技术是生物工程的重要组成部分，是生物高新技术产业化的关键要素，如酶工程、发酵工程等(干扰素、胰岛素、酶提取等)。了解蛋白质分离和纯化的重要性，在生物材料中分离和制造蛋白质，研究其结构和功能，了解生命活动的规律，明确生命现象的本质是很重要的。产业生产的必要性：食品、发酵、纤维、制革等产业需要很多活性酶制剂。用淀粉酶制作葡萄糖、麦芽糖、糊精、糖浆。医疗需要：用猪胰岛素治疗糖尿病。基因工程的需要：DNA合成酶、RNA逆转录酶等。蛋白质纯化策略、蛋白质分离常用的纯化方法包括超速离心和梯度密度离心方法、盐析法、电泳、凝胶过滤(分子筛)、离子交换色谱、亲和层析和高效液相色谱。亲和沉淀技术是纯化各种生物大分子最有效的方法之一。超速离心是分离细胞及蛋白质大分子的有效方法，往往是进一步纯化的第一次筛选。超速离心和差动离心和梯度离心。超速离心或梯度离心分离和纯化抗原只是根据蛋白质的比重特性，除个别成分外，分离特定抗原成分的极其困难的方法。目前，大部分分子抗原(如IgM、C1q、thyroglobulin等)和一些比重较轻的抗原蛋白(如apolipoprotein a、b等)仅用于此类蛋白。大量高分子量蛋白质不适合用超速及梯度密度离心力作为精制。盐析沉淀法是最古老、最经典的蛋白质纯化和分离技术。方法简便、有效，且不损害蛋白质抗原活性的优点，因此现在也被广泛使用。盐析方法原理、盐析沉淀法的原理保证了蛋白质是亲水性大分子，因此水溶液中具有双电层结构的水合膜保持分子的溶解度平衡和稳定存在。添加盐后，盐电离到离子状态，离子的电性破坏蛋白质的双层水合膜结构，使其沉淀和沉淀。不能添加强酸和碱，假环境使蛋白质变质。凝胶过滤器和离子交换色谱凝胶过滤也称为凝胶柱色谱、分子筛色谱，利用微孔凝胶分离分子量不同的成分。离子交换色谱利用一些带有离子组的纤维素或凝胶吸附带相反电荷的蛋白质，根据带电荷的电荷的差异或数量，将蛋白质分为不同的成分。如果同时使用这两种色谱之一或重复使用，就可以从复杂成分中提炼出一种蛋白质。，凝胶过滤(分子筛色谱)图标1，凝胶过滤(分子筛色谱)图标2，离子交换色谱柱，亲和色谱是利用生物大分子的生物特异性，即生物分子间的特异性亲和力设计的色谱技术。例如，抗原和抗体(免疫亲和层析)、酶和酶抑制剂(或配体)、酶蛋白和辅酶、激素和受体之间有特殊的亲和力，在一定的条件下，它们可以紧密地结合成复合物。将合成物的一边固定在不溶性载体或共享价格上，可以从溶液中学分离和纯化另一边。亲和层析与上述其他纯化方法相比，能产生相当高的纯化效果。另外，该方法速度快，但有时只需一步就能达到精炼目的。免疫亲和纯化技术，亲和纯化(affinitypurification)基于目标分子与固定化配体(如抗原抗体)的特定相互作用。亲和技术可以用于从混合物中分离某些分子。捕捉目标分子，进行相互作用研究，或用于从反应系统中去除成分。免疫亲和纯化原理，免疫亲和纯化是分离各种生物大分子的最有效方法之一：1，高纯化速度，一般是1，000-1，000倍以上。2、目标抗原的数量很少，为了获得均匀性产物，必须与其他方法结合。3、快速纯化抗原，色谱柱经常可重复使用。可以根据不同的规模进行，在半天内完成。4、不仅适用于纯化抗原，还可以用于分离初步纯化的抗体，甚至可以与相应配体有效结合的所有生物分子。5，抗体与相应抗原的结合具有高度亲和力和特异性，可以大量分离自然状态或几乎自然状态的抗原。6、需要适当纯化的抗体，并非所有抗体都适合免疫亲和层析，但一旦获得性能好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠。7、不能用于定量测量。免疫亲和纯化技术发展历史：抗体被用作免疫亲和纯化的结合剂，根据自身的交联结合，制造了大量聚合物和不溶性基质原理，收集了抗原。抗体和惰性珠的共享结合是简单的结合，但抗体的很多反应性因定位作用或抗体的过度结合而丧失。研究发现，抗体与蛋白质a和蛋白质g维共享结合后，更容易与抗原结合。抗原结合特性优良、多种原生抗体制成免疫亲和层析柱成为最合适、最有效的纯化方法。亲和层析是Cuatrecasas等最早建立的(1968年)。BCX2003P2。PPT，影响免疫亲和层析纯化效果的因素抗原初始相对浓度(即纯度):是决定最终产物纯度的非常重要的因素。抗原和抗体的亲和力：免疫亲和纯化色谱中最麻烦的问题。改性抗体(10-8mol/L)可以在1小时内实现有效分离，而低亲抗体(10-6 mol/l)即使在高浓度的情况下也不能结合溶液的全部抗原。对同一抗原的多个表位使用多克隆抗体提高亲和力的方法不仅结合了更多的抗原，而且提高了溶出难度。仅当所需的最终产物是变性蛋白质时，才选择识别多个表位的抗体。免疫亲和纯化的关键：高亲和力、易溶出的优化组合。一般的错误是把低亲和力和容易被利用等同起来。1 .选择：作为亲和色谱支持物应满足以下要求：非特异性吸附低；液体经过时流速要快。在各种pH和高浓度盐溶液中稳定。要有能与蛋白质或其他化合物有效结合的适当而丰富的化学组。为了增加结合能力，必须丰富微孔。满足上述五个条件的支撑物包括琼脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其中常用琼脂糖珠(Sepharose2B，4B，6B)。，2 .选择配体：所谓配体系统是指抗原和抗体的免疫亲和色谱，表示友好的双方。好的配体要具备以下三个条件：(1)抗原或抗体必须具有单一特异性。抗原或抗体的纯化效果取决于固相配体的纯度。(2)抗原和抗体之间要有很强的亲和力。这种亲和力决定抗原决定基的性质和数量。抗体还决定于马抗血清亲和力低、免疫血清亲和力高等抗体源动物的种类和免疫时间；免疫时间短的亲和力低。但是太强的亲和力是不可取的。因为分解抗原抗体复合物所需的条件本来就很强，能使蛋白质变质。例如，低ph (1.5 2.5)或高盐(例如盐酸6mol/L胍)会减少或失去某些抗原或抗体活性。(3)配体必须有适当的化学组。该组不参与配体与大分子的特定结合，但可以用于连接支持物，这种联系不应影响配体与大分子结合的亲和性。3 .抗原或抗体与支持体的结合，将抗原或抗体与支持物结合的方法目前有20多种，但可以概括为载体结合法、物理吸附法、交联法、网络法4种。结合法的一般步骤是先激活支撑体的作用机理，然后将抗原或抗体连接到这些激活的组。用于交联的化学反应必须足够温和，以免抗原或抗体受损。交联后，必须彻底冲洗支撑物，去除剩下的交联物质。Separose4B最常用，在pH11中处理此支持和deltamethrin时，支持功能将处于活动状态。这时溴化氰化物和支撑物的羟基反应形成氨基甲酸酯组。添加溴化氰化物的数量取决于支持物的数量。要提高取代度，添加溴化氰化物的量也要增加。交联应首先注意添加抗原或抗体浓度。一般来说，在交联反应混合物中，交联蛋白质浓度必须是亲和分离浓度的20 30倍。用这种方法，溴化氰浓度也要提高到200mg/ml凝胶。如果希望最终产物的含量少，则添加的溴化氰也应减少。要注意，交联时，pH也在ph 9.5 10中活性的琼脂糖珠非常不稳定。降低PH值会降低可反应的配体浓度，从而减少交联量。亲和色谱中常用的小分子抗原或其他化合物，与支撑物交联，因载体空间的位置阻力影响与抗原或其他亲化合物结合，产生所谓的无效吸附。另外，Sepharose4B交联需要游离氨基，如果该抗原有氨基转移，则很难进行交联。两个原因都是，通常在琼脂糖和抗原之间连接不同长度的“手臂”。必要时，可以将这些“臂”端与游离氨基连接起来，与无氨基配体结合。“臂”琼脂糖通常是氨基琼脂糖(二亚胺)、羧基琼脂糖(琥珀酸酐)、溴乙酰琼脂糖(0-溴乙酰-n-羧基琥珀酰胺)、重氮衍生物琼脂糖(叔基琼脂糖)用带“胳膊”的婴儿做的这种糖有商品供应，使用很方便。注：不建议将未纯化的多克隆抗体或混合单克隆抗体用于免疫亲和纯化。免疫亲和纯化色谱的基本步骤：交联洗脱1，抗体和基质(珠)共价交联和抗体亲和色谱柱制备。2、将抗原结合在抗体-基质微珠上。3，抗原溶出。亲和层析条件选择：(1)支持物与抗原或抗体结合后，还可能存在额外的活性组，要关闭这些残留组，必须用无关蛋白质或三乙醇胺过一次热，关闭活性组。(2)去除未结合、未结合的蛋白质。首先用0.2mol/LNaHCO2(含0.1mol/LNaC1，pH9.0)溶解两三列卷，然后用解放剂处理亲和层析柱。(3)解放制有多种。通常为0.2 moll/lph 2.8甘氨酸- HC1缓冲液，0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲液，7mol/L尿素，5mol/LNaI，3mol/L硫氰酸钾(或钠)，以及最常用作抗原抗体解放剂的是3mol/L硫氰酸钾(或钠)和0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲液。抗体亲和层析柱制备：抗体和固相基质连接：1，最常用的基质是蛋白质a和蛋白质g维，可以特异性地结合抗体的Fc功能区。2，将抗体直接与活性珠(表达活性的反应器)联系起来。抗体和维氏的结合方法，在免疫亲和层析柱中溶解抗原：理想的洗脱峰是清峰，用单缓冲液处理后，可以完全释放抗原。探索最佳溶出条件是积累经验的工作。有三种方法：1，以更强的条件处理；2、饱和小分子化合物添加模拟结合部位；3、使用引起结构变化释放抗原的试剂。作为清洁液和洗脱液的选择免疫沉淀技术，将抗体及其抗原的高亲和力检测到目标分子并在溶液中结合的方法，将抗原收集到惰性微珠中，快速、轻松地纯化1000-10000倍。免疫沉淀，免疫沉淀的应用：1，目标抗原的纯化。2、确定蛋白质相对分子质量。3、蛋白质抗原寿命的测定。4、蛋白质翻译后修正的决定。5、研究蛋白质和蛋白质之间的相互作用。6，蛋白质内部或相关酶活性的测定。7、裂解特定抗原去除。免疫沉淀的特征：1，抗原存在的测定，质量，大小，转化，修饰和相关性；2、多个阶段共需要1/2-1天。3、从半定量到定量；4、灵敏度取决于抗原的相对质量和抗体的亲和力；5，需要高亲和力的抗体。免疫沉淀的主要影响因素：1，抗原原液的丰富度2，抗原的抗体亲和性，选择合适的抗体，免疫沉淀阶段：1，抗原溶液的制备2，裂解非特异性背景预处理3，免疫复合物的形成和纯化http:/www . bio . daidcson . edu/course，2，选择热分解液：为了保护抗体结合部位，避免蛋白质溶解，尽可能温和的分解条件，但要确保充分激烈的分解条件，抗原的定量释放。在洗涤剂方面，非离子型优于离子型，低浓度优于高浓度，短离子优于混合型。免疫沉淀最常用的洗涤剂是NP40和RIPA，释放大部分可溶性细胞质蛋白和核蛋白，不破坏染色体DNA。最好不要释放DNA，因为它会影响溶液的粘合性。3，裂解原理：在释放尽可能多的抗原，尽可能少的诱发蛋白质变性的前提下，将可溶性抗原与基质颗粒分离，避免大分子DNA进入溶液并将其去除。4，裂解方法：组织培养细胞的裂解：最常见的问题是抗原没有完全从细胞中释放出来。一般不建议使用冻融法，原因不明，因为一旦冻融循环，蛋白质可能会过度分解。机械剪切(使用超声波发生器、双均匀机、波特装置和搅拌器等)特别适用于不使用大规模制造或洗涤剂的情况。最有效的方法是用洗涤剂处理。细菌裂解：最常用的方法是对细胞进行短、高频率的超声波处理，破坏几乎所有细菌细胞壁，切割DNA小分子，在不影响样品粘合性的情况下操作，样品质量好，成本低。最常见的问题是，蛋白质抗原在分解时可以变性。酵母细胞分解：最好是制作玻璃珠和酵母细胞一起旋流的机械粉碎。这是利用玻璃珠快速旋转撞击酵母，机械粉碎酵母细胞的有力分解方法。最常见的问题是蛋白质抗原的变性。变性分解：对多种来源抗原的有效分解方法是用强大的变性溶液处理细胞，释放大部分蛋白质抗原。然后稀释或透析降解物