干扰载体构建SOP

shRNA干扰载波构建SOP目录第一部分RNA干扰原理和shRNA设计4第二部分酶切和回收7第三部分退火和连接9第4部分转印涂装平板11第五部分筛选菌和菌液PCR13第六部分质粒提取15第一部分RNA干扰原理和shRNA设计标准操作规程(SOP )1 .目的：理解RNA干扰的原理，设计shRNA干扰序列2 .设备和设备：需要能连接互联网的电脑、底漆设计相关软件(Primer Premier 5等)。3 .操作步骤3.1 RNA干扰原理1) RNAi概述RNAi干扰(RNAi )在进化过程中是保守的，是由双链RNA (双链RNA，dsRNA )诱发的，同源mRNA有效特异性分解的现象。 简单来说，是分子生物学上由双链RNA引起的基因沉默现象。 当向细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA分解引起基因表达的沉默，是特异性转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesincing )。 RNAi具有高度的序列特异性和有效干扰，能特异性地使特定基因沉默，得到基因功能的丧失和基因表达量的降低，可以作为功能基因组学的有力研究工具。 RNAi技术广泛应用于功能学、药物靶向筛选、细胞信号转导通路分析、疾病治疗等方面。2) RNAi原理： RNA干扰包括起始和效应阶段。 在初期阶段，小分子RNA被切成21-23核苷酸长度的小分子干涉RNA片段(小界面rnas，siRNAs )。 证据是被称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异性地识别双链RNA的成员，通过一种依赖于ATP的方法从外来导入，或者通过基因重组、病毒感染等各种方法导入的双链RNA逐渐切断，形成19-21bp的双链RNA 在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合体，形成RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencecomplex，RISC )。 为了激活RISC，需要将ATP依存的小分子RNA分解成双链的过程。 活化的RISC通过碱基对定位于相同的mRNA转录体上，在距离SiRNA 3端12个碱基的位置切断了mRNA。 虽然切断的正确机制尚不清楚，但RISRISR中含有siRNA和Dicer不同的RNA酶。3) RNAi映像(参照图1 )3.2 shRNA设计1) shRNA:即短头发RNA (短头发RNA )包括两个短的反复序列(其中一个与目的基因互补)，中间用一个loop序列划分，构成发夹结构。 shRNA在体内被加工成siRNA，可以分解目的基因。 图2示出了示意图。2) shRNA的作用原理：参见图3。3) shRNA设计原则：l克隆到shRNA表达载体的shRNA包含两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop )序列划分，构成发夹结构，由pol启动子控制。 然后，将56个t作为RNA聚合酶iii的转录终止子l2个互补寡核苷酸两端必须有限制酶切部位l StrataGENE发现，与最初推荐的23个寡核苷酸相比，29个寡核苷酸更能有效地抑制目的基因l在启动子下游的酶切部位下连接c，使插入片段和启动子保持一定的空间间隔以确保转录的发生l shRNA目的序列的第一个碱基必须是g以确保RNA聚合酶的转录。 选择的目的系列不以g开始时，必须在正义链接的上游加上gl ShRNA插入片段的茎环应该接近寡核苷酸的中央。 很好地使用了不同大小和核苷酸序列的茎环。 其中含有独特限制酶切断部位的茎环有利于检测具有shRNA插入片段的克隆。 在不同长度和序列比较的茎环上，5TCAAGAG3序列是最有效的(AMBION use )。l 5-6个t必须放在shRNA插入片段的尾部以确保RNA聚合酶的转录停止l在正义链和反义链的序列中连续出现3个以上的t，有可能导致shRNA转录的早期终止从l转录(mRNA )的AUG起始编码中寻找“AA或NA”二连序列，记录其3末端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA目标部位。 正义的锁链和反义的锁链，是使用这个19碱(AA和NA的重复除外)设计的。图1 RNAi原理图2 shRNA示意图图3 shRNA作用原理4) shRNA设计的例子l以人源基因VEGFC为例，选择了干扰目标序列： GCCGATGCATGTCTAAACTl在该序列的两端加入酶切部位，在中间插入Loop环，设计shRNA片段BamH I靶序列环结构靶反义序列hindgatccgcgatgcatgtctaacttcagattagacatgcatcgctttttagcgctacgtacagattgaaagtctcaatctgtacgtagccgaaaaattcgal正反Oligo系列分别如下H-VEGFC-sh-F:5- gatcgccgatgcatgtctaatcagagagaagttagaatgcatcgtttta-3H-VEGFC-sh-R:5- agcttaaagccgatgcatgtctctgaagttagaatgcgcgcg-3将该Oligo片段正反混合退火后，可以直接与载体连接，构建shRNA干扰载体。第二部分干扰载波pRNAT-U6.1的概要标准操作规程(SOP )实验名称shRNA干扰载波构筑SOP S2 :干扰载波pRNAT-U6.1的概要起草人/修订者几章荣修订日期2015.7审计员审计日期批准者批准日期发行部门1 .目的：了解干扰载波pRNAT-U6.1的特征2. pRNAT-U6.1载体的概要l拥有U6启动子，保证shRNA的高表达l带有GFP标签，可以用于检测感染效率l具有多克隆部位l具有新霉素耐性，可用于稳定的细胞株的筛选3. pRNAT-U6.1载波地图图1 pRNAT-U6.1载波图第三部分酶的切断和回收标准操作规程(SOP )实验名称shRNA干扰载体构建SOP S3 :酶切断和回收起草人/修订者几章荣修订日期2015.7审计员审计日期批准者批准日期发行部门1 .目的：通过酶切得到具有酶切部位的线性化质粒载体，用试剂盒回收。2 .试剂和材料名字公司货物号码限制性酶热烈公司tube1.5ml毫升axxygen0.2mL PCR tubeaxxygen循环净化工具包。奥米加D6492-013 .仪器和设备名字公司货物号码maxygenethermcycliraxxygenMaxyGeneGradient移液管大龙掌上型离心机那个林铃LX-200战斗机恒温浴锅精宏DK-80战斗机4 .操作步骤4.1酶切以Thermo内核酸酶为例，准备冰箱，从冰箱中取出必要的试剂，放在冰上，试剂溶化后，放入离心管0.2mL10缓冲塘go 5l内切核酸酶HindIII 1L内切核酸酶BamHI 1LshRNA干涉质粒pNAT-U6.1 1gddH2O up to 50L关闭软管盖，离心15s。 将0.2mL离心管放在离心管架上，放入37的水浴锅中，切除酶1h (时间长度因酶的反应效率而异，请参考产品说明书)。 也可以直接使用PCR装置进行酶切反应。Notes:根据l酶的特征可能要求BSA，可以根据说明书操作。 双酶切断时，如果只有一个酶需要BSA，因为BSA不影响内切酶的活性，所以还需要向酶切断系统中添加BSA。l如果两个部位的内切酶使用相同的缓冲液(即该缓冲液中酶活性最高)，则可以加入两种酶同时反应如果使用l不同的缓冲液，首先进行单酶切断，回收后，进行第二次酶切断，可以再次回收。l载体上的两个酶切位点通常很接近，有些酶需要更多的保护碱，同时进行双酶切可能效率不高。 加入需要更多保护碱(或酶切效率低)的内切酶，反应结束后回收(如果2种酶使用相同种类的缓冲液，则省略回收顺序)，和加入第二种酶进行反应。 酶切后的载体用凝胶电泳分离、回收纯化，除去切断的小片段，降低假阳性。4.2酶切物的回收以omega cycle pure工具包为例。1 )将酶切物转移到离心管1.5mL中，添加了酶切物体积的45倍的Buffer CP的PCR片段的长度小于200bp时，添加6倍体积的Buffer CP2 )涡流振动均匀，以短离心力收集管壁的液体3 )将混合物放入试剂盒提供的HiBind DNA吸附柱中，10000g，室温下离心1分钟4 )扔掉残液，加入700L DNA WASH Buffer，10000g，在室温下离心1分钟5 )重复步骤46 )废弃残液后，13000、室温离心2min；将HiBind DNA吸附柱放在清洁的1.5mL离心管中，加入15-30L Elution Buffer或ddH2O，在室温下离心1-2min、13000、室温下离心2min，收集DNA产物。第四部分退火和连接标准操作规程(SOP )实验名称shRNA干扰载波构建SOP S4 :退火和连接起草人/修订者几章荣修订日期2015.7审计员审计日期批准者批准日期发行部门1 .目的：退火单链shRNA上下游片段形成双链DNA片段，连接酶切断后的载体。2 .试剂和材料：名字公司货物号码5退火缓冲液自制shRNA Oligo片段华大基因ddH2O自制0.2mL PCR TubeaxxygenpRNAT-U6.1/Neo质粒载体金斯利号驱逐舰T4 ligase康为生物CW08053 .仪器和设备名字公司货物号码离心机热烈公司pico 17手持式离心分离机那个林铃LX-200战斗机maxygenethermcycliraxxygenMaxyGeneGradient移液管大龙4 .操作步骤4.1退火1 )按照下表，调制5退火缓冲液成分最终浓度特里斯公司50毫米(ph 8.0 )美国航空250毫米PS5毫米2 )将合成的Oligo片段用蒸馏水溶解稀释为100M，在离心管0.2mL中按照下表加入各成分Oligo F (100M )4LOligo R (100M )4L5退火缓冲液2L3 )一共10L，暂时离心后，将液体收集到管底，放入PCR装置，执行以下步骤955分钟804分钟754分钟704分钟652分钟602分钟552分钟502分钟452分钟402分钟372分钟20 20min程序结束后，可以在4下短时间保存，也可