GBT 27635-2011 斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法

1220B 41 蝠亘中华人民共和国国家标准 2763520 1 1斑点叉尾触嗜麦芽寡养单胞茵检测操作方法of 0121实施丰瞀徽鬻瓣警襻瞥星发布中国国家标准化管理委员会况10刖罱27635112009的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人：薛峰、蒋原、袁芳、王云飞、张睿、易海华、徐帮兴、邵卫星、马卉、栾军、陈国强、乔华林、谢怀根。1范围斑点叉尾触嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法本标准规定了斑点叉尾蛔嗜麦芽寡养单胞菌的分离与鉴定方法。本标准适用于对斑点叉尾鲴的嗜麦芽寡养单胞菌的分离、鉴定。2规范性引用文件2763512011下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件；仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。4789282003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂66822008分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。NA：通营养琼脂。豆胰蛋白胨琼脂。有万古霉素、亚胺培南、两性霉素设备和材料41冰箱：04。42恒温培养箱：28士1。43铂铱接种环或玻璃棒。44滤纸。45发酵管。 46天平：0g100g，精确至05g。47均质器或灭菌乳钵。48灭菌广口瓶：5009灭菌三角烧瓶：50050410灭菌培养皿：直径9011显微镜：10100。5试剂和培养基51试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合668212008规定的二级水，所用化学试剂1276352011均为分析纯。52普通营养肉汤、大豆胰蛋白胨琼脂(普通营养琼脂(普通羊血营养琼脂和可按4789282003中47规定)。53革兰氏染色液：按4789282003中22规定。54氧化酶试剂：按4789288规定。55糖发酵管：麦芽糖按4789282003中32规定。564789282003中451规定。57微量生化反应管：乳糖、水杨苷、乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、酸盐、柠檬酸盐、2一酮戊二酸盐、丙酮酸盐生化反应，丙氨酸、L谷氨酸盐、照4789282003中规定。580检验程序斑点叉尾鲴嗜麦芽寡养单胞菌检验程序见图1。 图1斑点叉尾蛔嗜麦芽寡养单胞菌检验程序7操作步骤27635样品处理液的制备以无菌操作取出有病症鱼体，直接从鱼体肝、肾等组织中采样。如果是体长小于4果是体长4鱼体或内脏258士1， 需氧培养24h，无菌取培养液作为样品处理液。 72细菌的分离将24于28需氧培养24 h，显微镜观察，背景未变化的单个优势菌落为可疑菌落。73可疑菌落筛选挑取背景未变化的单个优势可疑菌落于大豆胰蛋白胨琼脂或普通营养琼脂或者普通羊血平板，置于28需氧培养24h。观察菌落的大小、形态。在普通营养琼脂上菌落呈灰白色，圆形，表面光滑，边沿整齐的半透明菌落；在大豆胰蛋白胨琼脂(板上形成圆形，表面光滑，边缘整齐，直径01812普通羊血琼脂平板上出现明显的口溶血环，且溶血环呈草绿色，有强烈的氨味。符合以上菌落特征的为可疑菌株。74嗜麦芽寡养单胞菌的鉴定741革兰氏染色对可疑茵落进行革兰氏染色，嗜麦芽寡养单胞菌为荚膜，无芽孢，极生端鞭毛，鞭毛数不小于2。742氧化酶实验 使用铂铱接种环或玻璃棒，挑取单个可疑菌落，然后接种到用氧化酶试剂澜湿的滤纸上，如果在10罗兰或深蓝色为阳性，不变色为阴性，嗜麦芽寡养单胞菌为阴性。743麦芽糖氧化实验将可疑菌落无菌挑取到麦芽糖发酵管，28士1培养2h3h，观察结果。嗜麦芽寡养单胞菌为氧化麦芽糖强阳性。744该培养基上，围绕可疑菌落接种到上述8需氧条件下培养72h，观察结果。嗜麦芽寡养单胞菌为45其他生化反应745100体操作按照产品说明书进行。32763520117452微量反应生化管实验除可以利用微量反应生化管，做乳糖、水杨苷、乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐、丙 二酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、酸盐、柠檬酸盐、2一酮戊二酸盐、丙酮酸盐、组氨酸和L，脯氨酸生化实验。嗜麦芽寡养单胞菌均可以利用上述有机物，反应均为阳性。8结果报告可疑菌落全部符合74中的报告阳性结果：“检出嗜麦芽寡养单胞菌”，否则报告阴性结果：“未检 出嗜麦芽寡养单胞菌”。4A1普通营养肉汤A11基础培养基成分蛋白胨牛肉膏氯化钠蒸馏水A12制备附录A(规范性附录)培养基与试剂6B节，选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基，121152大豆胰蛋白胨琼脂(21基础培养基成分胰胨植物蛋白胨氯化钠琼脂蒸馏水A22配制用蒸馏水溶解培养基基础成分，调节确保灭菌后211523制备202(25)，选取合适大小的当基础培养基的温度降至4750时，混匀。倾注15置使凝固。A3普通营养琼脂培养基(31基础培养基成分蛋白胨氯化钠牛肉膏粉酵母膏粉12B2配制5节确保灭菌后士02(25)，选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基，1211533制备当基础培养基的温度降至4750时，混匀。倾注15置使凝固。A4普通羊血琼脂A41基础培养基A411成分动物组织酶解物淀粉氯化钠琼脂水A412配制230g180热以促进溶解。调节培养基在高压灭菌后，在24时的士o2，选取适当三角瓶进行分装。1211542合成培养基A421组分础培养基，见A41)菌脱纤维马羊血)A422制备100012250时，加入无菌脱纤维马羊血500匀。倾注15置使凝固。A51基础培养基A511成分蛋白胨牛肉浸膏12配制50627635热以促进溶解。调节培养基在高压灭菌后，在25时的4，选取适当三角瓶进行分装。1211552抗生素溶液A521成分j"古霉素