DB21∕T 2472-2015 H1N1亚型不同谱系猪流感病毒核酸RT-PCR鉴别诊断技术规范

41      宁省地方标准 1/T 24722015     1     2015 30发布 2015 30实施 辽宁省质量技术监督局   发布  24722015 I 前  言 本标准按照 009给出的规则起草。 本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本标准主要起草人：兰德松、顾贵波、赵凤菊、魏澍、李晓楠、孙世宇、杨作丰、李清竹、李红魁、申贯男、王海丰  24722015   言 猪流感（由染猪引起的一种严重的呼吸道及免疫抑制传染病，已在世界大部分国家广泛存在并造成严重经济损失，是目前危害养猪业的重大疾病之一。同时猪被认为是流感病毒重组的“混合器”，传衍化、跨物种传播以及在公共卫生学上都具有重要意义。从国内和我省近年来猪群中的检测结果来看，猪群主要以1禽型和甲型害最大。针对内尚无用本技术规范可在实验室对经典型、类禽型和甲型确诊断，进而有针对性地采取综合防控措施。因此，本规范对于猪流感的检测和控制具有重要的意义，同时也为人、猪、禽流感防控提供预警信息奠定重要基础。  24722015 1  范围 本标准规定了型典流感病毒（ 本标准适用于甲型典用于猪鼻咽拭子、脏器、鸡胚尿囊液及细胞培养物中本标准中的试验操作应在生物安全级（上的实验室进行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 兽医实验室生物安全技术管理规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 流感病毒（炭酸二乙酯（糖核酸（氧核糖核酸（基对（转录聚合酶链式反应（氧核糖核苷三磷酸（洛尼鼠白血病病毒（硫苏糖醇（酸缓冲液（4 原理 据母链引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板5 仪器和器材  24722015 2 高速台式冷冻离心机（最大离心力12 000  冰箱（28 ，和）。 电泳仪。 凝胶成像系统。 微波炉。 微量移液器。 6 试剂和材料 观为粉红色，分装至棕色瓶中，于48 保存。 仿：4 预冷。 丙醇：4 预冷。 5%乙醇：用新开启的无水乙醇和20 预冷。 7 作用1 h；（121士2），高压灭菌15 0 U/L）。 S  U/L）。 6.8 .5 )。 于，其序列如下： 经典型上游引物F: 典型下游引物R: 禽型上游引物F: 禽型下游引物R: 型上游引物F: 型下游引物R: 转录酶： U/L）。 .1 )。 转录引物2：0 ）。 性对照：性对照：不同谱系酸盐缓冲液（  羟甲基氨基甲烷化乙锭。 注：除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无7 操作步骤 品的采集、前处理、存放和运送 样注意事项 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，防止样本交叉污染。  24722015 3 样工具 病毒采集管；经121（士2）高压灭菌15  160 干热灭菌2 子。 鼻腔、咽喉拭子的采集与前处理 用病毒采集管采取临床疑似活体猪的鼻腔、咽喉拭子，编号备用，待检。 脏器的采集与前处理 取1克病死猪的肺脏，进行研磨，然后加入1 匀，3000 r/上清液转入1.5 胚尿囊液 将无菌收集盲传三代的鸡胚尿囊液转入1.5 胞培养液 细胞培养物冻融3次，转入1.5 放与运送 采集或处理的样品在28 条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置温度低于冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在68 照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。   中性管数+阴性管数，对每个离心管进行编号。 管加人750 L 别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各250 L，颠倒10次混匀，室温静置5 加入250 匀器上振荡混匀15 s(也可以用手反复颠倒混匀)。4 12000  入500 预冷)。倒混匀，室温静置15   12000 上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1 5%涤。   12000 上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。如此洗涤2次。 000 s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥310 入20 柔混匀，溶解管壁上的上保存备用。提取的需长期保存应放置冰箱。 转录 转录体系 建立25 下列组分加入离心管中：  24722015 4                                                 L .5 ）                                      2 L 物(20 )                                   1 L .1 )                                         L 5L 倍缓冲液)           5 L                                                                L                                            L 实验样品                                          5 L 转录条件 混匀后在37 水浴锅中反应1 h；在70 水浴锅中反应15 转录产物直接用于保存备用。 立25 下列组分加入X                                        L 反转录产物（                                   1 L 上游特异性0 )                          L 下游特异性0 )                          L 灭菌蒸馏水                                            L 4 预变性3 4 变性30 s，54 退火30 s，72 延伸1 5个循环；72 终延伸7 泳 取脂糖凝胶（见附录A）板加样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入000 子质量标准物质）6 L，缓冲液为15 V/电泳好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。 8 试验成立的条件 当甲型性对照出现在476 性对照未出现目的条带；经典性对照出现在293 性对照未出现目的条带；类禽型性对照出现在997 性对照未出现目的条带时，表明试验有效，否则试验无效。 9 结果判定  性判定 应用甲型典照各基因检测体系对样品进行检测，被检样品出现476 现293 现997  24722015 5 性判定 如果在所用不同谱系检测引物预期扩增片段的位置未出现目的条带，则判定为相应谱系 24722015 6 A  A  附 录 A （规范性附录） 试剂配制  配制 .2 磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠(2g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000匀。 .2 磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠(g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000 匀。 取0.2 磷酸氢二钠溶液360 磷酸二氢钠溶液140 取氯化钠38 g，用无离子水溶解稀释至5000 保存。 泳缓冲液(50倍) .5 乙二铵四乙酸二钠(液(二水乙二铵四乙酸二钠(分析纯)         g 灭菌双蒸水                            80 氧化钠                              菌双蒸水                            加至100  羟甲基氨基甲烷泳缓冲液(50倍) 羟基甲基氨基甲烷(分析纯)        242 g 冰乙酸                                 57.1 .5               100 菌双蒸水                             加至1000 时用灭菌双蒸水稀释使用。 %琼脂糖凝胶 琼脂糖(电泳级)             &