【基金标书】2010CB912300-基于基因密码子扩展的蛋白质标记新方法

项目名称： 基于基因密码子扩展的蛋白质标记新方法 首席科学家： 周德敏 北京大学 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部门： 教育部 一、研究内容 1、 拟 解决的关 键 科学 问题 （ 1）利用酪氨酸、亮氨酸和 吡咯赖氨酸 氨酰 成酶 /交对，以及大肠杆菌和酵母筛选系统，在蛋白质中特定位点引入特殊的非天然氨基酸，包括荧光氨基酸、具有生物正交化学反应性能的非天然氨基酸、高效率的光交联氨基酸、较大双光子吸收截面的光转化氨基酸、磷酸化的氨基酸、含有 19F 或自由基的氨基酸等。 （ 2）针对已有筛选系统效率不高 的问题， 发展结构生物学和计算生物学的方法 ，为筛选体系建立理论指导。 （ 3）发展和优化以“无铜点击化学”为代表的活体蛋白质特异正交标记技术。 （ 4）发展和优化氟取代化学反应，以期在蛋白质中引入 19F 探针，并优化荧光标记基团的性能。 （ 5） 发展 蛋白质特异标记方法，揭示哺乳动物细胞和线虫细胞的运动机理。 （ 6） 拓展 蛋白质特异标记方法，发现药物新靶标，优化蛋白质药物的靶向性和半寿期。 2、主要研究内容 本项目的主要研究内容是以在蛋白质特定位点插入非天然氨基酸为主要研究手段，结合超 高 分辨率荧 光成像、核磁和顺磁共振技术和结构生物学、蛋白质组学技术，深入研究细胞生物学和医药学研究中所涉及的重要科学问题。 （ 1）基因编码非天然氨基酸 筛选平台的构建 通过人工进化的方法增加编码非天然氨基酸。首先把无义密码子“ 定为新的遗传密码，进而对天然的转运核糖核酸（ 因突变 ,使其含有反密码子“ 在此基础上从氨酰 成酶突变库中，筛选出可专一结合这种 后再将生命体中 在培养基中加入化学合成 的非天然氨基酸，从而在蛋白质中的相应位置插入具有特殊物理或化学性质的非天然氨基酸。其简要技术路线见图 1: 图 1：基因编码的非天然氨基酸 的总体技术路线 及正负循环筛选途径 （ 2）真核细胞蛋白质翻译起始机制的解析 开关”，受到多种细胞胁迫信号的控制，与 因子发生直接作用，发挥尚待确证的复杂的生物功能。我们将通过在 析 合物的结构，并从分子机理，特别是磷酸 化的角度阐明细胞响应胁迫信号的途径。我们也将对蛋白翻译起始过程中起重要作用的细胞因子做荧光和光交联标记，以求获得对蛋白起始复合物动态调控机制的全面理解。 （ 3）细胞运动的分子机理解析 细胞中许多重要的生理活动，如细胞移动、胞吞、细胞浆移动等，都受肌动蛋白 (合的调控。 新的 化因子，具有非常重要的生理功能。为了研究它们在胞内 构中的精确定位，我们将具有光交联活性的氨基酸插入到 白中对它进行标记，发现新的相互作用蛋白并研究它们的动态相互作用，以及对其它核化因 子调控的影响。 我们还将使用基因转导方法在线虫活体中引入正交氨酰 成酶和 稳定表达系统，使得在线虫活体中可以用 止密码子编码非天然氨基酸。通过这个技术研究线虫精子运动的活化因子和活化因子的受体蛋白偶联的囊泡运输与胞吐。 （ 4） 细胞跨膜蛋白的受体激活和信号转导机理的研究 细胞膜上的受体蛋白如 一类极为重要的跨膜蛋白， 在 信号 转 导过程中发挥着关键作用，也是目前药物研发领域中最为关注的靶点之一 。 一类典型的膜蛋白，其螺旋链共七次跨膜，因而只有在活体细胞膜原位上进行研究 才有意义。这其中，如何在活体细胞内观察 状态、结构变化、偶联程度等都是研究的热点，对 作原理的动态跟踪更是目前人们最为关心的问题。 由于 荧光蛋白 的体积过大，对细胞跨膜蛋白的结构和性质所造成的干扰相当严重。我们希望通过基因编码的非天然氨基酸和生物正交反应对 行定点特异地小分子荧光标记， 从而在对 构和性质不造成干扰的情况下，特异、高效地 使用 单分子荧光等手段对 受体激活、信号 转 导机理等关键性问题进行研究 ， 在分子尺度上对 工作原理及信号 转 导过程中的结构变化进行 精确的观察与捕捉，解决现有研究手段无法涉及的难题。 （ 5）抗病毒药物靶标的发现 非天然氨基酸可以选择性插入到活体蛋白的任何位置，如果在病毒包膜蛋白上插入了具有光交联活性的非天然氨基酸，在病毒感染细胞的动态过程中，一旦受光照激发，该非天然氨基酸将会与病毒结合的细胞受体或辅助受体共价结合，从而捕捉新的抗病毒药物靶点。由于光照交联是不可逆的，通过弱的蛋白 会因此而富集起来，从而改善了蛋白免疫共沉淀方法的灵敏度和准确性。 将具有特殊化学、物理甚至生理性质的非天然氨基酸 引入到病毒的外膜蛋白上 ,将有可能整体推动病毒学研究，发现大量的新的药物靶标，为新型抗病毒药物研发奠定基础。 以上几个方向既是国际上生命科学研究的热点，也是我们研究的重点内容。 二、预期目标 1、总体目标 本项目的总体目标是 针对蛋白质科学前沿问题，设计和建立新的非天然氨基酸表达体系， 将具有特殊物理、化学性质的非天然氨基酸 表达 到活细胞中目标蛋白质的特定位点 ，并通过系统优化，推动该方法成为实验室常规技术 ， 使我国在该技术及应用方面跻身于国际前列。 2、五年预期目标 （ 1）突破性进展 通过本项目的实施，我们将 在蛋白质特异标记的技术、理论和方法等方面取得突破性进展： 系统建立在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞以及线虫活体中具有普适性的引入非天然氨基酸的方法，全面发展荧光、核磁、光交联、光转化和磷酸化等蛋白质特异标记技术。 将蛋白质特异标记技术应用于超 高 分辨率荧光成像，特别是通过优化蛋白质荧光标记技术，力争使我们的空间分辨率 的定位精度达到 10 做到实时活体观察 。 将蛋白质特异标记技术应用于细胞运动的分子机理研究 和药物靶标发现等 ，为我国 在生命科学基础研究领域和药物研发应用领域带来重大突破。 （ 2）研究成果 通过基因密码的扩展，大力发展蛋白质荧光、核磁、顺磁、光交联、光转化和磷酸化标记技术，并将这些技术结合 遗传学操作，应用于超 高 分辨率荧光成像、蛋白质动态相互作用、蛋白质磷酸化网络调控、细胞运动的分子机理探索。 在蛋白质翻译机理方面，从结构生物学的角度解析氨酰 成酶与 导基因密码扩展技术的研究。 发展以金属催化引入氟元素的方法学研究， 对探索合成新型小分子荧光探针或非天然氨基酸，直接氟代蛋白质等提供化学手段的支撑 。 建立一种通用方法，将非天然基酸引入到活病毒的包膜蛋白上，开辟病毒受体发现的新途径。 取得一批具有国际影响力的原创性成果， 在 国际重要学术刊物上 发表论文 50篇以上， 并力争在最高影响力的 发现1申请国内外 发明 专利 6项以上。 培养一批有国际影响力的中青年学术带头人和学术骨干， 培养博士研究生 30名、硕士研 究生 60名 。 系统优化蛋白质特异标记技术，为全国蛋白质研究提供一个全新的独特的研究方法 ，全面推进细胞生物学、化学生物学和医药学等领域的研究进展。 三、研究方案 1、总体 学术 思路 本项目 总体学术思路是 发展 基于基因密码子扩展的蛋白质 标记 的新技术，利用 在 化学生物学、蛋白质翻译机理 、蛋白质进化、以及医药学 方面的良好工作基础，针对更多蛋白质科学前沿问题，设计和建立新的非天然氨基酸表达体系， 将具有特殊物理、化学性质的非天然氨基酸 表达 到活细胞中目标蛋白质的特定位点 ，并通过系统优化， 推动该方法成为实验室常规技术 。 本项目 的 研究 目标是通过超 高 分辨率荧光成像、单分子荧光、核磁 及 顺磁技术提高对蛋白质定位和相互作用检测的精度；利用光交联技术 研究 具有重要意 义的动态蛋白质识别和相互作用 ； 利用具有光化学活性的非天然氨基酸 标记实现对蛋白质活性的高时空精度操纵 。 2、技术途径 （ 1）对非天然氨基酸具有特异性的氨酰 成酶的高通量筛选 首先， 修改大肠杆菌或酵母细胞内的遗传密码，使无义的“ 码对应于感兴趣的非天然氨基酸。 然后， 筛选对非天然氨基酸具有特异性的氨酰 技术路线如下： 在目标细胞中引入一个外源的氨酰 成酶和其 保持活性 且 不与内源的氨酰 成酶和 应 （ 生物正交性 ） 。 改变编码 氨酰 成酶活性氨基酸的 列 ， 建立氨酰 成酶基因突变库。 对氨酰 成酶突变库进行 如图 1 所示的 正负 循环 筛选 ，得到特异识别目标非天然氨基酸的 合成酶 变异体， 使其只催化 非天然氨基酸 间的 氨酰化反应。 （ 2） 基于非天然氨基酸标记的 超 高 分辨率荧光成像 普通光学显微镜的分辨率 和 灵敏度一百多年来一 直没有根本性的改善。 2006年美国科学家 次在 志上提出了光敏定位显微镜(概念， 其 基本原理是将荧光分子标记在目标蛋白上，结合全内反射显微镜 (单分子定位技术 ， 突破了光学显微镜分辨率的极限， 得到细胞内蛋白纳米级分辨率的精确定位 。 我们首先 用可被特定波长光激活的荧光基团标记蛋白，调节 405 光器 使 低能量照射细胞表面，一次激发出少量的荧光分子，其能量被高量子效率的 集，通 过高斯拟合，特异性地精确定位这些荧光分子。 然后 用 561光器漂白这些分子，使 之免于被下一轮的激光激发出来。之后 再次用 405 561激光分别激发漂白其他的荧光分子，进入下一次循环。 该 循环 经上百次后 将得到细胞内所有荧光分子的精确定位，最后再将这些分子的图像合成到一张图上，得到一种比传统光学显微镜至少高 10 倍以上分辨率的显微技术 ，其 定位精度 可能突破10 至 达 1 量级。 （ 3） 基于非天然氨基酸标记的 蛋白质复合物晶体生长和结构解析 首先 我们将运用动态光散射仪 ， 对获得 的蛋白质和稳定蛋白质复合 物样品 的溶液状态进行分析，考察其是否处于均一状态，在不同条件（温度、浓度、 的稳定形态和凝聚状态 ； 同时运用溶液光谱（包括 谱和荧光光谱）方法分析蛋白质在溶液中的构象变化 ，综合各种因素初步确定适合于结晶实验的条件。然后 摸索晶体生长的条件，尝试大量不同的沉淀剂、蛋白质浓度、 缓冲体系、以及不同添加剂等，得到高衍射质量的晶体用于 旦获得蛋白晶体，将利用 帮助进行结晶条件的优化和低温冷冻条件的筛选。具有高衍射能力的蛋白晶体将运用国内外同步辐射光源进行 高分辨率的 运用单波长反常散射法、多波长反常散射法、同晶置换法、和分子置换法解析各种蛋白和蛋白复合物的三维晶体结构。 (4) 基于非天然氨基酸标记的 蛋白质 19F 核磁共振研究 溶液 术是研究蛋白质 定蛋白质复合物三维结构的强大工具。 19F 由于具有较强的核磁信号对环境敏感 ， 而大多数生物大分子都不含氟元素，因此用 19F 标记蛋白可以产生很高的信噪比，在活细胞中获得蛋白质相互作用的动态信息和蛋白质复合物的动力学特征 ，而且 对蛋白质结构和功能的扰动达到最小 （ 19F 和氢原子的 半径类似 ） 。我们将选择分子量合适的蛋白质复合物，运用 19F 号，在活细胞中或接近生理条件的溶液状态下，研究这些蛋白质复合物，特别是低亲和力、瞬时蛋白质复合物的动态结构和性质、蛋白质之间相互作用的分子机制，探测蛋白质之间是否发生相互作用及其亲和力（ 蛋白质之间的结合界面等。 （ 5）基于蛋白质特异标记 的膜蛋白信号转导过程研究 我们首先将发展一种 可遗传性的小分子标记技术 ( 实现对活体细胞蛋白质的 定点、特异和低干扰度标记。 侧链上含有化学活性官能团的非天然氨基酸 将 以“遗传性标签”( 形式 嵌入 活体 蛋白质 当中，并随后 通过生物正交反应与小分子标记物特异结合。 这一方法有效地融合了现有 各种 标记手段的优势 ， 在保持高特异性的基础之上，最大限度地模拟目标蛋白质的原有自然状态，为精准和严格的蛋白质标记需求提供一类有效的工具。 含有叠氮基团的非天然氨基酸将作为验证这一方法的切入点。 在此基础上，我们将把 术应用到 膜蛋白受体的 究当中 。利用该技术 尺度小、特异性强、效率高 、标 记物荧光性能好， 标记位点 灵活等特色 ，对 膜蛋白 上 变化最为显著的胞内 和 同时进行标记，有效提高 究 的灵敏度 和准确度，并进而开展 单分子 究 。 相信这些手段能够使我们更加精准、清晰、实时地揭示这类重要受体蛋白的激活机制和信号转导途径。 （ 6） 基于蛋白质特异标记 的细胞运动研究 在线虫中进行 细胞运动研究，我们将 首先使用基因操作的方法，在线虫活体中实现正交氨酰 成酶和 的稳定表达，从而使我们在线虫活体中可以用 止密码子编码非天然氨基酸。随 后，我们将利用正向遗传学、反向遗传学和细胞生物学结合生物信息学的方法，筛选与精子发生、精子活化、精子运动及精卵结合中关键缺失突变体（或可根据点突变体表型从 取缺失突变体），克隆其基因，在目标基因中引入 止密码子以编码非天然氨基酸。通过基因枪或显微注射法 ， 导入由 动子驱动单拷贝编码非天然氨基酸修饰的相关蛋白的 大大加强我们在活体水平研究线虫精子细胞发生及运动的机理的能力。 在哺乳动物细胞中进行 细胞运动研究，我们将用非天然氨基酸的方法标记白，在该蛋白中插入非天然氨基酸， 实现对 该蛋白的荧光标记 ,而 且 尽可能减少对目标蛋白的定位和功能的干扰 ； 用光激活和光转化的荧光基团标记特异性地观测局部的 现在活细胞内观察 核化以及延伸过程 ；利用 自主研发的 超高光学分辨率显微镜系统、 术， 实现 细胞运动研究 领域的技术突破， 观察 以前从未观测到的分子影像和行为。 （ 7）基于 蛋白质特异标记 的药物靶标发现研究 技术路线如下： 构筑 特殊 细胞包装系， 使 非天然氨基酸引入到病毒包膜蛋白 上所需的特殊 氨酰 成酶 和 定表达 。 重组 病毒基因，将非天然氨基酸的特殊编码子 于病毒基因的 合适 位置 。 转染 病毒基因 ，制备 外膜蛋白 含有 具有光交联 活性 非天然氨基酸 的活病毒。 在 病毒 感染 宿主细胞的动态 过程中 ， 光照激活非天然氨基酸 ,使病毒与结合的细胞蛋白共价交联 。 通过病毒包膜蛋白抗体沉淀和凝胶电泳等方法 ,分离和回收 共价交联 蛋白 。 通过高分辨质谱和碎片分析技术以及与蛋白组学对照，解析交联蛋白的氨基酸序列和组成。借助以上 方法 ，我们将寻找 病毒感染细胞 所依赖的受体， 尤其是呈 瞬间 方式或 结合力弱 的辅助受体，为 药物靶标 发现提供新的研究手段。 3、创新 点与特色 （ 1） 构建新颖的“大肠杆菌 梭体系和分子进化平台，实现在大肠杆菌内高通量，高多样性的定标式分子进化和将筛选结果直接导入哺乳动物细胞，用于高效表达含有非天然氨基酸的哺乳细胞蛋白质。 （ 2） 基因编码 具有增强光交联或光转化效率的非天然氨基酸， 提高 发现 与 确认蛋白质相互作用的效率 ， 使 高 时空精 确 操纵蛋白质磷酸化网络 成为可能 。 （ 3） 基因编码磷酸化的氨基酸， 使研究动态蛋白质复合物的结构 成 为可能。 （ 4） 将金属催化引入氟元素的反应与蛋 白质标记相结合 ，突破了以往蛋白质标记的 方法学 局限 。 （ 5） 将金属引入到荧光分子染料中用于蛋白质的标记， 建立 时间分辨荧光分析法（ 有效地区分背景荧光干扰，突破目前以有机染料为主的小分子荧光探针的固有缺陷。 （ 6） 将含有 叠氮基团 （ 适合参与生物正交反应 ） 的非天然氨基酸引入 到 生物体内 ， 可以 作为活性官能团参与各种化学反应 ， 是推动 生物正交点击反应 这一 新 领域向前迈进的重要步骤。 （ 7） 光激活的非天然氨基酸选择性地标记局部的 ， 可以显著提高 分辨率 ， 精确 解析 在细胞中的定位 ； 通过具有光交联活性的非天然氨基酸标记 ，有望 发现全新的相互作用蛋白，对于阐明化和组装过程有望取得开创性的进展。 （ 8） 将非天然氨基酸引入到病毒的包膜蛋白上从而发现新的病毒受体， 这 是一个国际尚未开展的领域，有可能带来病毒学研究的重大突破。 4、可行性分析 （ 1） 近年来将非天然氨基酸引入到大肠杆菌所表达的蛋白质中的技术在 国外 已日臻成熟，引入到哺乳动物细胞表达的蛋白质中在国际上 已开始 有相关的报道，同时蛋白质特异标记所面临的 问题也越来越具体 ，聚焦改善非天然氨基酸引入效率的相关研究也有了深入的进展。国内 北京大学和中科院生物物理所在该领域也已有了几年的积累 ，并从国外引进数位开拓这一研究领域的学术骨干（均为本项目学术带头人）， 为 进一步 开展 蛋白质特异标记技术研究 ，提供了宝贵的基础，蕴含着取得重大突破的良机。 （ 2）本项目的课题设置是沿着发展蛋白质特异标记技术的主线，以解决细胞生物学和医药学中的重要科学问题和需求为目标， 结合了国际上蛋白质研究的最新需求，总结了物理、化学和生物学等多学科研究最新进展的基础之上提炼出来的。 课题组 一和课题组二在 将非天然氨基酸插入到细菌和哺乳动物细胞所表达的蛋白中，已经取得了丰富的成果，具有了深厚的积累，表明本项目的研究方案和技术路线是可 行的， 为本项目取得突破奠定了基础。课题组三和课题组四 在细胞 运动 和病毒学研究领域，也取得了骄人的成绩，为课题组一和题组二 的 研究成果在生命科学研究领域深入展开提供了保证。 （ 3）本项目 研究队伍 以富有经验的院士 和原 973 首席科学家为指导，以30的青年科学家为骨干，更重要的是组成这支队伍的大部分研究人员具有在国外著名大学 5 至 10 年甚至更长的研究经历，分别在化学生物学、分子生物学、结构生物学、细胞生物学、医药学等方面具有深厚的研究功底，在各自领域取得了国际领先的成绩。同时他们之间有长时间的合作基础、优势互补， 已经形成了紧密的合作关系，这对于合作研究和攻关技术难度高、科学意义重大的课题有不可取代的优势，为本项目的实施和完成奠定了良好基础。 （ 4） 本项目以北京大学和中科院生物物理所为依托，特别是生物物理所生物大分子国家重点实验室、北京大学分子动态与稳态结构国家重点实验室、稀土材料化学及应用国家重点实验室、天然药物及仿生药物国家重点实验室，以及正在筹建的蛋白质国家实验室、分子科学国家实验室和北京大学综合性药物研究大平台等，为本项目实施提供了重要的组织保障和技术支撑，具备了优越的研究条件。 5、 组织方式 （ 1） 在组织上强 调体系化，瞄准总体目标，追求可持续发展。组织管理和运作体制分项目和课题两个层次。项目设首席科学家 1 人，负责整个项目的实施。首席科学家聘任若干专家组成项目专家组，参与项目的组织、运行、领导和管理，协助首席科学家，审核和确定项目的学术思想、技术路线及研究计划，指导协调各课题的工作，督促并考核各课题的进展情况。项目专家组由各学科领域成就卓著的专家组成，承担单位之外的专家将占较大比例。 （ 2） 在技术方面，本项目将实施整体性运作方案。在充分发挥项目各承担单位的学科优势和关键技术研究实力的基础上，强调优势力量的整合和 协同攻关，切实克服“各自为战”的做法，形成功能配套、布局合理、机制灵活的创新体系。 （ 3） 在项目实施过程中，充分体现技术平台共享，资源共享，人才队伍共享。 针对蛋白质特异标记技术重大科学问题，本项目课题的设置包括蛋白质特异标记技术的分子生物学方法（课题一）；蛋白质特异标记技术的化学方法（课题二）； 基于蛋白质特异标记的活细胞高时空 精度 监控新方法（课题三）；基于蛋白质特异标记的药物靶标发现新方法（课题四） 。 课题四 基于蛋白质特异标记 的药物靶标发现新方法 课题一 蛋白质特异标记技术的 分子生物学方法 课题三 基于蛋白质特异标记的活细胞高时空精度监控新方法 物学中的应用 课题二 蛋白质特异标记技术 的化学方法 本项目的课题设置是沿着发展蛋白质特异标记技术的主线，以解决细胞生物学和医药学 中的重要科学问题和需求为目标，有的放矢地将化学和分子生物学方法紧密结合起来，以求获得蛋白质特异标记方法和应用两个方面的重大突破 。课题一到四之间紧密相关、相互依托互补。如课题二发展的新的氟代合成方法将有助于合成各种氟代的氨基酸，以进行课题一氟代氨基酸的基因编码研究。课题一和课题二是课题三和课题四发展的基础，如课题二发展的氟代 卟啉具有 改进的荧光性能，将有利于课题三超 高 分辨率荧光成像的研究和课题四病毒感染细胞生物过程的追踪，课题一发展的基因编码荧光氨基酸和光交联氨基酸的技术，将有利于课题四药物靶标的发现。课题三和 课题四的需求和研究成果也将直接推动课题一和课题二的发展并彰显其重要价值。课题三和课题四之间可以互相借鉴，推动整个生命科学的发展。总之本项目的四个课题相对独立，但又有着天然的有机联系，相互之间的合作将极大地提高本项目的整体研究水平。具体的课题设置见下： 课题一、蛋白质特异标记技术的分子生物学方法 主要研究内容： （ 1） 高通量筛选平台的建立 基因编码非天然氨基酸的关键是获得 转运 特定非天然氨基酸 的 特异氨酰 成酶 ，其 步骤简述如下： 首先对多样性 达 109以上的氨酰 成酶突变库进行正筛选， 目的是 从中富集能够识别氨基酸的蛋白质合成酶突变体子集。 当该突变库 和 与 其对应的筛选载体一同转入大肠杆菌中 ,在非天然氨基酸存在的情况下进行氯霉素筛选。由于 正筛选载体上含有 琥珀终止子（ 氯霉素抗性基因 ， 当氨酰 成酶 能够识别某种氨基酸 并 将其附加在 ，转运 读过（ 有 氯霉素抗性基因时， 大肠杆菌母体才能存活，而没有活性的变异体将被氯霉素杀死。 图 2：（ A） 高通量筛选平台的建立；（ B）代表性非天然氨基酸。 正筛选 后所得 的合成 酶变异体子集 再经过一个 负筛选 ，目的是 将 其中 识别天然氨基酸的变异体排除。 当变异库子集 和 与 其对应 负筛选载体一同转入大肠杆菌中 ,在不 存在 非天然氨基酸的情况下进行毒性基因（ 力筛选。由于负筛选载体上含有 琥珀终止子（ 性基因，当变异体识别 天然氨基酸并 将其附加在 ，转运 读过含有 毒性基因时， 产生的毒性 蛋白 将大肠杆菌母体杀死 ， 而没有活性的变异体 随 其母体 的存活 而存在 下来。 经过正负双筛选， 只有 仅 识别非天然氨基酸的变异体得到了富集。 经过上述正负筛选 2 至 3 轮的 交替进行，原本多样性极高的分子进化变异库，能够朝向某种特定的 非天然氨基酸逐步富集， 最终得到特异识别指定非天然氨基酸的 氨酰 成酶 。 （ 2）基因编码非天然氨基酸实现体内磷酸化网络的光学调控。 蛋白质磷酸化 /去磷酸化是信号转导最重要的途径之一。 哺乳动物细胞中有数百种蛋白激酶和磷酸化酶，他们在细胞分化、细胞周期、胁迫信号的应答、及癌症和糖尿病的发生中具有其重要作用。 利 用 基因敲除 技术研究它们的功能，往往会由于目标基因的下调使与其 功能 相 似的基因迅速上调 而 补偿 其缺失 ， 从而影响基因功能的解析，这是目前研 究 激酶和磷酸化酶的 最 大障碍。 另外由于每个蛋白激酶和磷酸化酶常有好几个结构功能高度类似的同源基因，很难得到对某一激酶具有特异性的小分子拟制物。 本子课题 以在乳腺癌和糖尿病中具有重要意义的 切入点， 发展利用光学手段特异调控蛋白功能的方法。 由于 催化需要 参与，通过扩展基因密码 技术，将 冬氨酸，这种突变体将失去酶活 性 。在用 720 双光子激 发后，非天然氨基酸 脱保护而形成天冬氨酸，从而生成有活力的 于采用了 双光子激发，这种方法具有高度的时空 可控性。在上调 活后，我们将用蛋白质组学的方法分析蛋白质磷酸化的状态，从而确认 作用底物、调控机制、以及在乳腺癌和糖尿病发生中的作用。 （ 3）基因编码具有优良性能的光交联非天然氨基酸 图 2B 中所示的非天然 氨基酸 1 在 360 有很大的吸收常数（ 104） ,相当高的量子产率和较好的水溶性。这些化学物理性质决定了如果将 1 引入到蛋白的特定位点，它对蛋白结构和聚集状态的影响较小，只需要较弱的近紫外光就可以在较短时间内实现光交联。利用蛋白质组学的技术，我们将可以捕捉到动态的蛋白相互作用 。 图 3. 利用光学方法控制酪氨酸磷酸化酶（ 活性。（ A） 有结合底物的结构。（ B） 合底物的结构。 （ C） 催化机制。（ D）光保护 天冬氨酸的脱保护机制。 （ 4）基因编码含有 19F 的非天然氨基酸和含有自由基的氨基酸 通过高通量筛选，我们将基因编码含有 19F 的氨基酸 4，和含有自由基的氨基酸 5，由于 19F 核磁和电子自旋顺磁信号对环境的敏感性， 我们将可以利用这种方法探测蛋白质直接的相互作用，以及蛋白质和 间的相互作用。这些方法将和荧光成像的方法构成互补。 （ 5）蛋白质翻译起始的分子机理研究 蛋白质翻译的分子机制是现代生命科学研究的核心问题之一，也是基因密码扩展工作的基础。生物体内的蛋白质合成是由核糖体依据 板来完成的。首先，起始 结合到核糖体上，然后再与 板结合并搜寻到正确的翻译起始位点 (这一过程通常被称为“蛋白翻译起始”，而其中所需的各种因子则被统称为“蛋白翻译起始因子”。真核生物的蛋白翻译起始因子（ 包括数十种多肽及其组成的多种复 合体 ， 子之间及与核糖体的相互作用 也 极为复杂， 涉及到生物体最基本的生命活动， 是 现代 生命科学研究的焦点。对 子的结构生物学研究，对于阐明蛋白翻译起始的分子机制有着独特的重要意义和极大的推动作用，在目前已经获得的十几个 子的结构中，本实验室独立解析了其中的三个结构。 许多 子本身就是由多个亚基所组成的复合物 ，如 以与 起始 运 到核糖体 40S 小亚基上。当起始 确识别 ， 与 合的 生水解，导致 核糖体上释放出来，此无活性的 须在鸟苷酸交换因子 催化作用下，才能转变为 活性状态而重新进入下一个翻译起始的过程。这一步骤 受到多种细胞信号的调节，其中最为重要的是 酸化的 未磷酸化的 比，对 结合能力显著提高，可以竞争性的占据 催化位点并抑制 活性，从而抑制生物体内蛋白质的合成。 图 4. 真核细胞蛋白翻译起始机制。 开关”，受到多种细胞胁迫信号 的控制，与 因子发生直接作用，发挥复杂的功能。通过在 们将进行蛋白质复合物的结构解析工作（如 合物， 复合物），试图从分子机理（特别是磷酸化）的角度理解细胞响应胁迫信号的多种途径。我们也将在多种蛋白翻译起始过程中起重要作用的因子做荧光和光交联标记，以求获得蛋白起始复合物的动态调控机制的全面理解。 这些重要的信息将被利用来更进一步优化和发展真核细胞中的蛋白质特异标记技术。 预期 目标 通过建立 高通量的筛选平台，基因编码荧光、光交联、磷酸化、光转化的氨基酸。 实现对蛋白质动态复合物的检测，实现体内磷酸化网络的光学调控。对多种蛋白翻译起始过程中起重要作用的因子做荧光、光交联和磷酸化标记，通过蛋白晶体学和组学的手段以求获得真核细胞蛋白起始复合物的动态调控机制的全面理解。这些重要的信息将被利用来更进一步优化和发展真核细胞中的蛋白质特异标记技术。 承担单位 中国科学院生物物理研究所 课题负责人 龚为民 主要学术骨干 王江云 经费比例 24% 课题二、蛋白质特异标记技术的化学方法 主要研究内容 ： 本课题旨在发展蛋白质特异标记的化学技术，通过非天然氨基酸在活体蛋白质中定点引入以叠氮基团为代表的化学活性官能团，发展基于生物正交反应的蛋白质荧光和亲和特异标记，并以此开展膜蛋白信号转导机理等方面的研究。同时，发展新的氟代合成方法，以进行氟代氨基酸和氟代金属 卟啉合成 ，并将 它们用于蛋白质的 19F 核磁共振研究和荧光成像研究，为 探索 生命科学提供一 系列崭新 的研究工具。 （ 1） 我们首先将 发展一种通用的化学标记方法 ， 在非天然氨基酸的引入 过程 中，将结构、性质各异的标记物标记在活体蛋白质上 ， 对活体蛋白质进行定点官能团化 ，并在此基础上开展与小分子标记物的正交特异反应， 实现对蛋白质高效和低干扰度的小分子特异标记技术 (由于 标记物 在尺度上远小于目标分子，不会对蛋白质的结构造成影响。 我们将 首先含叠氮基官能团的非天然氨基酸 作为 目标分子 ， 通过 子课题所述的筛选方法 ， 获得 特异的蛋白质合成酶变异体， 使这类官能团 定点、高效、高保真 地 插入到哺乳细胞的蛋白质当中。 我们前期的实验已经证明 应的蛋白质合成酶（ 大肠杆菌和哺乳细胞中都是正交的，可以用来开发一个在大肠杆菌和哺乳细胞之间进行穿梭的体系 (图 5)。 图 5：细胞蛋白质“遗传 特异”标记的 分子进化平台 （ A）“大肠杆菌 梭系统，用于非天然氨基酸的进化筛选和定点特异表达。（ B）具有光保护基团的赖氨酸类似物 C）在哺乳细胞蛋白质上定点表达的 在 365源 的照射下分解产生赖氨酸。 在此基础之上 ,我们将以带有叠氮基团的非天然氨基酸作为研究主线，先完成这类氨基酸的化学合成和 分子 进化 筛选，从而实现 在活体 细胞蛋白质上嵌入叠氮“标签” （图 5A） 。 通过 我们发展的 法 ， 使生物正交反应来特异标记蛋白质成为可能 。 图 6：向活体细胞蛋白质嵌入叠氮“标签”。（ A）将含叠氮基的多种非天然氨基酸表达于活体细胞蛋白质上，并在活体细胞内开展生物正交的点击化学反应。嵌入叠氮“标签”的蛋白质与带有张力环诱导的炔基的标记物分子将共价结合。（ B）拟合成并进行定标式分子进化筛选的含叠氮基非天然氨基酸。（ C）拟合成并进行定标式分子进化筛选的含炔基非天然氨基酸。 作为多种生物信号的受体和调控蛋白， 细胞信号转导过程中 发挥着关键作用。 如何在活体细胞内观察 状态、结构变化、聚合程度、动态工作原理等都是当前研究的热点。我们开发的 术将是一个极为有效的工具， 在对 构和性质不造成干扰的情况下，特异、高效地对 其进行 我们拟通过双 位点 术 对 变化最为显著的 和 同时进行标记，并 对 作原理进行 究。该方法除了低干扰度这一特点以外，还能够对 变化尤为显著的 和 分别进行标记，它们之间相对位移 产生的 号将极大地增强观察的灵敏度。通过对这些小分子荧光标记物参与的 及单分子荧光研究 ， 能够使我们在分子尺度上对 工作原理和信号传导过程进行捕捉和把握 (图 7 C)，解决以前方法 无法应对的挑战。 （ 2） 选择性氟取代反应及蛋白质的金属卟啉标记 特异性 F 标记的蛋白质在蛋白质折叠，催化，物质运输过程的表征上有着非 图 7 细胞穿膜蛋白 究 .（） 结构与组装。 （ B） 术定点嵌入叠氮标签。（ C）双位点 常重要的应用。通过 19变化，人 们可以观察到在上述过程中蛋白质结构所发生的变化。但是， 活化是有机化学最大的挑战之一， F 原子的体积很小，电负性很强导致了 的键能非常高，这使得 活化在热力学上比较不利，另外由于 F 原子的配位能力比较弱，亲核取代和氧化加成的能力也比较弱，这就使得 活化在动力学上也有着比较大的困难。氟转移也是人们关注的热点之一。氟的电负性大，通过直接氟化反应，反应的选择性低，不利于特异性的氟转移反应。我们将致力于发展在温和的条件下，利用过渡金属催化的方法来活化 ，而且同时进行 F 的选择性转移，并将其 应用于蛋白质的氟标记上。我们最近发现了一个 化的发生 活化和氟转移的反应。目前正在对这个反应的细节，机理进行进一步的探索。期望能够优化该方法，使该反应能在温和条件下进行，并将之用于氟标记蛋白质修饰。 同时我们也将发展新的卟啉类化合物作为蛋白荧光标记物。 选择卟啉类的有机小分子作为荧光探针的原因是： 1）在与光合作用有关的光敏体系中，金属卟啉展示出了高消光系数、稳定等优点。尤其是，通过氟代修饰后，稳定性和荧光强度大大加强； 2）卟啉化合物可在紫外激发，在可见光区有发射 ,且发光量子效率高，有效消除背景噪音 ； 3）卟啉结构易于修饰及对生物大分子进行标记（如以上提到的点击化学）。 4）与金属配位形成金属卟啉发光配合物后，可以发出长寿命的磷光（可达 将金属卟啉配合物的长寿命磷光运用于 时间分辨荧光成像（ 可以以时间作为窗口，有效地区分背景或其他组分的荧光干扰，增加对比度。我们将合成一系列具有荧光性能，可以穿过细胞膜，同时可以和目标蛋白质进行点击化学特异反应的 金属卟啉，实现对目标蛋白质的特异标记，并进行超 高 分辨率荧光成像研究。 预期 目标 构建分子进化平台和“大肠杆菌 梭体系。实现含叠氮基的多种非天然氨基酸在哺乳细胞内蛋白质上的高效表达， 并通过生物正交反应将小分子荧光标记物与嵌入如膜蛋白 中的叠氮标签在生物体内特异连接，由此开展 单分子 究。开发新的氟代反应，合成具有理想荧光性能的 金属卟啉化合物， 配合点击化学方法实现蛋白质的特异标记。 将上述特异标记技术应用到更 为广阔的研究范畴，解决一系列生命科学和药物研究领域内的重大问题 。 承担单位 北京大学 课题负责人 陈鹏 主要学术骨干 张俊龙、赵新生 经费比例 24% 课题三、 基于蛋白质特异标记 的活细胞 高 时空 精度 监控新方 法 主要研究内容： （ 1） 利用非天然氨基酸特异标记技术研究哺乳动物的 装过程 许多重要的细胞生理活动如细胞移动、胞吞等都受 合的调控。核化过程是胞内 成的限速步骤， 是 细胞生物学研究领域的热点和前沿方向。为新的核化因子，具有非常重要得生理功能。研究表明， 与了果蝇卵母细胞极性轴的形成，在胚胎发育过程中起着非常重要的作用。然而迄今为止，有关 控 组装和去组装过程的研究尚有许多关键性的科学问题没有解决 。 本课题旨在应用非天然氨基酸标记技术 研究 构中的精确定位，发现全新的相互作用，阐明其如何调控 装等关键科学问题。 本课题中我们用非天然氨基酸标记 研究其定位和功能，可以尽量避免荧光蛋白标记因体积较大而影响目标蛋白的定位和功能的缺陷。我们用光激活和光转化的非天然氨基酸可以特异性地标记局部的 合我们建立的 超高光学分辨率显微镜系统 可以 看到以前从未观测到的分子影像和行为， 实现在活细胞内观察 核化以及延伸过程 。另外， 我们将在 白质上两个位点同时进行荧光标记， 通过 察和捕捉 化过程中 细微结构变化，阐明 与 配的作用机制。 在本课题中用具有光交联活性的非天然氨基酸标记 细胞响应刺激后的不同时期实现光交联，有望发现全新的相互作用蛋白，对于阐明 化和组装过程有望取得开创性的进展。 （ 2） 利用蛋白质特异标记技术研究线虫 细胞运动 线虫因其生活周期短结构简单是研究发育过程的基因调控元件相互作用的模式生物。线虫精子是高度特化的细胞，成熟精子细胞中不再有蛋白转录表达。因此，精子细胞细胞极性建立、精子细胞运动、精卵识 别以及精卵受精均是蛋白质翻译后修饰基础上的蛋白 们 将 围绕线虫精子细胞运动的分子调控机制，利用蛋白质特异标记技术，重点解决以下关键科学问题： 1. 线虫精子细胞极性建立的分子机制。 线虫精子细胞极性建立是指在胞外活化因子作用下，无伪足不具运功能力的球形精子细胞活化成为具伪足可运动的极性精子。我们进行线虫精子缺陷突变体筛选，鉴定线虫雄性体内的活化因子；而后，利用基因编码非天然氨基酸技术，在活化因子中引入荧光标记，结合 绘线虫精子活化因子与精子 细胞表面受体间的相互作用，并研究活化因子的作用方式和作用机制。 2. 线虫精子细胞伪足骨架组装、解聚和动态调控的信号网络。 线虫精子细胞运动是伪足介导的细胞运动，伪足胞质 们将以新鉴定出的调节因子为突破口研究线虫精子迁移过程中，调控因子的动态变化，以研究线虫精子细胞伪足骨架组装、解聚和动态调控的信号网络，以及线虫精子迁移过程中伪足与基质的相互作用。另外，线虫精子细胞伪足骨架组装是与蛋白质酪氨酸磷酸化修饰相偶联的。通过基因编码光保护的酪氨酸、和光交联的氨基酸，我们将详 细研究酪氨酸磷酸化在精子细胞伪足装配信号通路中的关键作用。 （ 3） 利用 新型荧光探针在活细胞中特异标记蛋白质错误折叠蛋白质 蛋白质错误折叠的研究是神经退行性疾病发病机制研究领域中的重大科学问题。在中枢神经系统中蛋白质错误折叠产物 有 两种 ： 以包涵体形式存在的蛋白质错误折叠聚积物 （胞内）和 淀粉样蛋白质聚积物 （胞外） 。目前已 有 一些在体外标记错误折叠蛋白质的荧光标记物如 以及 ，但 尚未见 特异标记胞内错误折叠蛋白质的有效荧光探剂。 我们 将开发出一种特异标记神经系统重要蛋白质错误折叠产物的荧光探针，通过 荧光显微镜直接显示错误折叠蛋白质进入细胞以及在细胞内的动态过程，为研究由蛋白质错误折叠导致的疾病分子机制，提供新的细胞学方法。该新型荧光探针的研究和使用将回答：蛋白质如何错误折叠，错误折叠蛋白质如何进入细胞 以及 细胞内 的 分布；错误折叠产物如何导致细胞代谢障碍及死亡的机制。 我们 发现 为蛋白质的修饰荧光产物 ,可用于标记蛋白质在错误折叠过程中的荧光探针。该化合物来自一种细胞膜脂氧化代谢产物，可以诱导神经系统重要蛋白质的错误折叠，并形 成在光学显微镜下 受 激 产生 青色荧光的标记物。通过该 探针 ， 我们 首次观察到了错误折叠的蛋白质产物被小胶质细胞泡饮的过程 ， 从而初步证明了蛋白质聚积物可以泡饮的方式而通过细胞膜（相关研究结果正在申请国家发明专利）。这个技术将被用于研究错误折叠蛋白质组神经细胞内分布以及由此而导致的细胞功能障碍的分子机制，同时也可以进行细胞内错误折叠蛋白质的动力学研究。这种新荧光探剂方法的研究与建立，将对蛋白质错误折叠在细胞内代谢和细胞功能障碍的研究领域起到推动性作用。 预期 目标 通过非天然氨基酸标记技术结合超高分辨率显微成像术，研究 装过程中的精确定位和功能；研究 过调控 装配在高等生物中介导了怎样的生物学功能；发现 1 互作用蛋白。 使用基因操作在线虫活体中实现 正交氨酰 成酶和 的稳定表达，使得我们在线虫活体中可以用 止密码子编码非天然氨基酸。基因