midkine特异的shrna对胃肿瘤细胞bgc823增殖及凋亡的影响

精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创1/12MIDKINE特异的SHRNA对胃肿瘤细胞BGC823增殖及凋亡的影响【摘要】目的研究SHRNA干扰MIDKINE对胃肿瘤细胞BGC823增殖能力及凋亡的影响。方法构建MIDKINE基因的特异性小RNA干扰质粒，采用脂质体2000转染BGC823细胞，运用CCK8检测细胞的增殖能力，PI染色检测细胞凋亡情况。结果成功转染重组体的BGC823细胞增殖明显受到抑制P【关键词】MIDKINESHRNA胃肿瘤细胞细胞增殖细胞凋亡ABSTRACTOBJECTIVETOINVESTIGATETHEEFFECTOFKNOCKDOWNOFMIDKINEMKEXPRESSIONBYSHRNAONCELLPROLIFERATIONANDAPOPTOSISOFHUMANGASTRICCARCINOMACELLBGC823METHODSSPECIFICSHRNAPLASMIDSTOMIDKINEWERECONSTRUCTED,ANDWERETHENTRANSFECTEDINTOBGC823BYLIPOFECTAMIN2000THECELLPROLIFERATIONWASEVALUATEDBYCCK8KIT,ANDTHEAPOPTOSISWASDETERMINEDBYFLOWCYTOMETRICANALYSISRESULTSTHERECOMBINANTPLASMIDEXPRESSINGMIDKINESHRNAEFFECTIVELYINHIBITEDBGC823CELLPROLIFERATIONPKEYWORDSMIDKINESHRNAGASTRICCANCERCELLCELLPROLIFERATION精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创2/12APOPTOSISMIDKINEMK是一种肝素结合生长因子，MK在多种正常组织中也有表达，在小肠黏膜组织高表达，在肺、结肠、胃、肾和脾低表达，在肝脏中没有表达，MK在多种肿瘤组织中的表达比相应的癌旁和正常组织高1。在我们前期研究工作2中发现MK在中国胃肿瘤患者的肿瘤组织中高表达，并与临床分级相关。在多种肿瘤细胞系中，MK具有促纤溶、促血管形成和抗凋亡作用，能诱导NIH/3T3细胞、SW13细胞和UNUC3细胞转化1,3。胃癌患者的尿液和血清中的MK水平都有所增加45，肿瘤切除后血清MK水平就会下降6。这些资料表明MK与胃肿瘤的发生发展相关，可作为诊断指标和治疗靶标。本研究旨在以MK为靶标进行干扰，观察MK干扰后胃肿瘤细胞增殖及凋亡情况。1材料和方法材料肿瘤细胞BGC823细胞株购自中国科学院细胞所。PSILENCERU6和PSILENCER载体PSILENCERU6和PSILENCER载体购自AMBION公司，PSILENCERU6的载体含有U6RNA聚合酶启动子PSILENCER载体含有H1RNA聚合酶启动子。两者都同时含有氨苄青霉素和G418抗性基因，前者可用于在原核细胞的筛选，后者则可用于在真核细胞的筛选。2个载体在购买时呈开环的线状，两端精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创3/12分别留有BAMHI和HIND的酶切位点。主要试剂PI为南京凯基生物公司产品LLIPOFECTAMIN2000转染试剂和OPTIMEM购自INVITROGEN公司各种限制性内切酶、总RNA提取试剂盒、质粒抽提试剂盒、反转录试剂盒、核酸电泳试剂均为TAKARA公司产品PCR扩增试剂为天为时代公司产品。方法发夹状双链MKSIRNA基因序列的合成根据前面研究中MKSIRNA序列7设计发夹双链RNA基因序列，正义链5GATCCGTGAAGAAGGCGCGCTACAATGCTCATTCAAGAGATGAGCATTGTAGCGCGCCTTCTTCATTTTTTGGAAA反义链5AGCTTTTCCAAAAAATGAAGAAGGCGCGCTACAATGCTCATCTCTTGAATGAGCATTGTAGCGCGCCTTCTTCACG3。序列由IVITROGEN公司合成。合成的MK发夹状双链RNA基因序列的两端分别引入BAMHI和HIND两个酶切位点。然后，按照下列方法把合成的2条单链DNA配对形成双链以50L去离子分别溶解合成的2条单链DNA分别取5L溶解的单链DNA，然后加入40L1DNA退火溶液100MMOL/L醋酸钾、30MMOL/LPHHEPES、2MMOL/L醋酸镁混合903MIN，冷却至37并保温1H，逐步冷却至室温，这样2条单链DNA就配对形精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创4/12成了双链，并且其两端设计合成的BAMHI和HIND黏性末端也暴露出来了。20保存备用。PSILENCER和PSILENCER质粒的构建购买的PSILENCER和PSILENCER是已经含有BAMHI和HIND酶切位点的线形载体，故可以用以下方法连接上述已经配对形成双链的MK发夹状RNA的基因1LMK发夹状RNA的基因,6LDDH2O,1L10T4DNA连接缓冲液,1LPSILENCER或PSILENCER载体,1LT4DNA连接酶5U/L，把上述液体混合均匀，16过夜，转化感受态DH5，随机挑取菌落于含100MG/L氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，进行测序，序列正确的即为PSILENCER和PSILENCER质粒。对照质粒插入的片段为针对GFP的序列，称为PSILENCER和PSILENCER。构建质粒的转染和阳性克隆的筛选肿瘤细胞在24孔板上用PRMI1640培养基，含10的小牛血清和青霉素、链霉素在375CO2细胞培养箱中培养至9095的细胞覆盖率。然后，吸去培养液，用不含青霉素、链霉素和小牛血清的PRMI1640培养基洗1次。细胞转染按LIPOFECTAMIN2000质粒转染操作说明进行操作，质粒用量为G，转染后375CO2下培养72H。总RNA提取、REVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTIONRTPCRRNA提取按照TRIZOL试剂盒操精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创5/12作指南进行，并通过琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA的完整性。反转录依照试剂盒操作说明进行，总反应体系为25L，反转录条件为42反应60MIN，PCR引物MK385BP，28个循环，上游的引物5AAAAAAGCTTATGAAAAAGAAAGATAAGGTGAAGAAG3。下游引物5AAAAGAATTCCTAGTCCTTTCCCTTCCCT3ACTIN280BP，28个循环，上游引物5CCACGAAACTACCTTCAACTCC3下游引物5TCATACTCCTGCTGCTTGCTGATCC3。CDNA产物直接取2L加入PCR反应体系进行PCR扩增。PCR反应程序为94变性30S，55退火30S，72延伸30S，28个循环后，72维持5MIN，反应结束后，取5L反应产物进行1琼脂糖凝胶电泳，鉴定扩增产物。细胞增殖活力检测细胞增殖活力检测参照CCK8KIT说明书进行操作，详细方法如下将转染PSILENCER和PSILENCER、空载体和未转染的细胞悬液按100L/孔加入96孔培养板中，每组孔做6个复孔。375CO2饱和湿度下培养。在1、2、3、4、5天，每孔中加入10LWST822METHOXY4NITROPHENYL34NITROPHENYL52,4DISULFOPHENYL2HTETRAZOLIUM,MONOSODIUMSALT，置375CO2饱和湿度继续培养4H，于酶标仪HYNERGYTMHT,BIOTEK,USA450NM处比色，精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创6/12获得光密度D值。平板克隆形成实验将不同处理并对数生长期细胞接种到6孔板，每种细胞接种3孔，1000个/孔，以十字方向轻轻晃动6孔板，使细胞分散均匀。在37、5CO2的培养箱中，静止培养710天至6孔板出现肉眼可见的克隆7。PBS小心洗涤细胞2次，甲醇固定30S，结晶紫液染色15MIN，流水缓慢洗去染色液，空气干燥。凝胶成像系统拍照计数克隆数。PI检测亚二倍体峰不同处理的细胞，胰酶消化PBS洗，2000RPM约375G，离心5MIN，获得细胞107/ML取100L细胞悬液，加入1ML70乙醇用过滤除菌的双蒸水配制固定2H用PBS洗细胞2次，4，2500R/MIN，5MIN2次100LPBS2TRITONX100,2RNASEA重悬细胞加入100LPI染液，4避光显色30MIN4，加300LPBS流式细胞仪FLOWCYTOMETER,FCM检测8。统计学处理实验数据用S表示，利用ONEWAYANOVA进行组间统计学分析，P2结果MK干扰后MRNA表达水平的检测将构建的PSILENCER和PSILENCER质粒利用LIPOFECTAMIN2000转染到BGC823细胞，通过RTPCR检测双链发夹RNA对MK的抑制作用。PSILENCER和PSILENCER转染72H，在BGC823细胞中MK精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创7/12的MRNA表达水平都明显降低，而ACTIN的表达没有受到影响。空载体对MK和ACTIN的表达均没有影响图1。2种质粒的干扰效果相比没有明显差别。图1MK干扰后通过RTPCRMKMRNA表达水平检测MDL20001处理组2处理组3处理组4处理组5未转染细胞双链发夹MKRNA对细胞生长的抑制作用为检测低表达的MK对BGC823细胞生长状况的影响，细胞存活能力用CCK8KIT检测。在第1、2、3、4、5天,与未转染细胞和转染空载体的细胞相比，转染了SIRNAPSILENCER和PSILENCER质粒的BGC823细胞增殖能力明显受到抑制图2。从集落形成实验结果图3可以看出转染了PSIRNAPSILENCER和PSILENCER质粒的BGC823细胞的克隆数与对照组相比降低了约4倍。这些结果说明MKSHRNA能显著的抑制BGC823细胞的生长。转染了SIRNAPSILENCER和PSILENCER质粒的BGC823细胞增殖能力受抑制程度没有明显差别。后面的实验选用PSILENCER质粒转染细胞。双链发夹MKRNA促细胞凋亡的作用处于增殖周期中的细胞，根据其所处的周期不同G0/G1、S、G2/M，其DNA含量分布在24倍体之间。发生凋亡的细胞由于细胞内的DNA断裂成许多小片段，在用乙醇固定后，用细胞膜通透剂DNA抽提液使小分子量的DNA片段穿过细胞膜，使细胞内精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创8/12原有的DNA部分的丢失，仅剩下大片段的DNA，这些细胞在DNA染色后，用流式细胞检测术检测其DNA含量，会出现1个DNA含量转染PSILENCER质粒以后，BGC823细胞的凋亡百分比为，而对照组没有转染的细胞凋亡百分比小于2，转染空载体的细胞凋亡百分比小于图4A。对流式细胞仪分析结果进行统计分析，结果如图4B3次实验的平均值所示，与未转染细胞和转空载体的细胞相比，转染了PSILENCER质粒的BGC823细胞凋亡数明显增多，具有统计学意义，转染空载体细胞与未转染细胞相比细胞凋亡数的差别无统计学意义。3讨论近年来以MK为靶标进行疾病治疗得到了关注，小鼠MK反义寡核苷酸能抑制直肠癌细胞CMT93的生长9MORPHOLINOANTISENSEOLIGOMER能抑制PC3细胞和SW620细胞体外生长和体内成瘤10。但是，反义寡核苷酸技术抑制特定基因的表达存在着其自身不可克服的缺点作为分子探针的反义寡核苷酸只能外源合成，再注射到体内发挥作用反义寡核苷酸在合成时为避免被体内各器官组织中的核酸酶分解，都必须进行修饰。因此，利用反义寡核苷酸药物进行治疗成本高、疗程长，在治疗过程中必须连续多次给药才能保证体内的反义寡核苷酸浓度。而且长时间注射外源反义寡核甘酸有可能在体内引发干扰素精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创9/12的产生，导致非特异阻断基因的表达。与反义寡核苷酸技术相比，RNA干扰技术RNAINTERFERENCE,RNAI更灵敏，可避免干扰素效应，能高效、特异地引起基因转录后沉默，使其丧失表达蛋白或多肽的能力，并且可以通过多种方法给药。目前，RNAI技术已广泛应用于基因功能、信号传导通路的研究以及基因治疗新策略的研究。我们前期研究发现针对MK特异的SIRNA能有效抑制细胞增殖、并促进细胞凋亡11。在本研究中我们使用的SHRNA是由RNA聚合酶启动子U6和H1从DNA模板上转录产生的，其对哺乳动物细胞能产生RNA干扰作用。RNA聚合酶的优势在于能直接从53转录产生小的非编码RNA，并在遇到45个连续的T后就中止转录。RNA聚合酶启动子的这种特性使得它在体内从DNA模板上转录出的SIRNA与在体外合成的SIRNA的活性非常一致12。本实验结果表明转染PSILENCER或PSILENCER质粒可以明显抑制胃肿瘤细胞BGC823生长图2，并且促进细胞凋亡图4，效果与直接使用SIRNA一致11，另外与直接使用SIRNA相比可以大大节省成本，并且可以实现稳定转染，但两种启动子的转录效果没有差别。总之，本研究证明，RNA聚合酶启动子启动转录产生的针对MK的SHRNA可以抑制胃肿瘤细胞BGC823生长并促进细胞凋亡，这为MK基因靶向治疗提供一定的实验依据。精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创10/12【参考】1KADOMATSUK,MURAMATSUTMIDKINEANDPLEIOTROPHININNEURALDEVELOPMENTANDCANCERJCANCERLETT,2004,20421271432HUANGYL,CAOGC,WANGH,ETALTHEEXPRESSIONANDLOCATIONOFMIDKINEINGASTRICCARCINOMASOFCHINESEPATIENTSJCELLMOLIMMUNOL,2007,421351403MURAMAKIM,MIYAKEH,HARAIINTRODUCTIONOFMIDKINEGENEINTOHUMANBLADDERCANCERCELLSENHANCESTHEIRMALIGNANTPHENOTYPEBUTINCREASESTHEIRSENSITIVITYTOANTIANGIOGENICTHERAPYJCLINCANCERRES,2003,914515251604IKEMATSUS,OKAMOTOK,YOSHIDAY,ETALHIGHLEVELSOFURINARYMIDKINEINVARIOUSCANCERPATIENTSJBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN,2003,30623293325OBATAY,KIKUCHIS,LINY,ETALSERUM精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创11/12MIDKINECONCENTRATIONSANDGASTRICCANCERJCANCERSCI,2005,96154566KAIFIJT,FIEGELHC,RAFNSDOTTIRSL,ETALMIDKINEASAPROGNOSTICMARKERFORGASTROINTESTINALSTROMALTUMORSJJCANCERRESCLINONCOL,2007梅，魏钦俊，朱义保，等PRLR基因反义RNA对人乳腺癌细胞系MCF7增殖的影响J南