研究肺炎链球菌候选蛋白疫苗clpp的保守性和抗原性

精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创1/11研究肺炎链球菌候选蛋白疫苗CLPP的保守性和抗原性摘要目的评价酪蛋白裂解酶PCLPP作为候选疫苗的保守性和抗原性，分析在不同血清型肺炎链球菌（SPN）中的表达情况方法以TIGR4型SPN的CLPP基因序列设计引物，分别以12株不同血清型SPN的基因组DNA为模板，对CLPP基因进行聚合酶链反应PCR扩增、胶回收产物与PMD18克隆载体连接后进行测序，运用生物信息学方法对其核苷酸及推测的氨基酸序列及抗原性进行分析，并利用WESTERNBLOT方法检测12株不同血清型SPN的CLPP蛋白的表达情况结果12株不同血清型SPN的CLPP基因序列和GENBANK数据库对已公布的TIGR4型SPN的CLPP基因一致性，推测的氨基酸序列一致性WESTERNBLOT结果显示ANTICLPP多克隆抗体与12型SPN的菌体蛋白能够起交叉反应结论CLPP蛋白在不同型SPN之间同源性高，在不同型SPN菌株中均有表达CLPP是一个具有前景的SPN候选蛋白疫苗因子关键词肺炎链球菌；CLPP基因；序列分析；抗原性0引言肺炎链球菌（STREPTOCOCCUSPNEUMONIAE，SPN）是引起获得性肺炎、中耳炎、鼻窦炎的主要病原菌随着多重耐药菌株的不断发现，疫苗在预防和控制SPN感染中的作用越精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创2/11来越重要1SPN根据荚膜可分为90多个血清型，开发对所有血清型SPN都具抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前SPN疫苗的发展方向研究发现的SPN蛋白质候选疫苗酪蛋白裂解酶PCASEINOLYTICPROTEASEP,CLPP）是ATP依赖的丝氨酸蛋白水解酶2，其在SPN的生存、致病和入血过程中起着重要的作用34，针对其靶点的疫苗或抗生素也越来越显示出其潜在的价值本研究探讨CLPP在不同SPN菌株中的保守性与抗原性，以及在不同血清型SPN中表达情况，旨在为自主开发SPN蛋白疫苗奠定基础1材料和方法材料菌种与质粒12株不同血清型SPNCMCCB31109SEROTYPE1，CMCCB31203SEROTYPE3，CMCCB31446SEROTYPE4，CMCCB31011SEROTYPE5，CMCCB31207SEROTYPE6B，CMCCB31507SEROTYPE7F，CMCCB31216SEROTYPE9V，CMCCB31614SEROTYPE14，CMCCB31687SEROTYPE18C，CMCCB31693SEROTYPE19F，CMCCB31759SEROTYPE23F（北京中国医学细菌保藏管理中心），NCTC7466SEROTYPE2，国际通用名为D39（欧洲国家标准菌种库）；大肠杆菌DH5A和原核表达系统含PET32A/CLPP重组质粒BL21DE3重庆医科大学临床检验诊断学重点实验室，金精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创3/11黄色葡萄球菌标准菌株重庆医科大学微生物学教研室，质粒PMD18T载体试剂盒日本TAKARA公司试剂DNA提取试剂盒，凝胶回收试剂盒及日常型质粒DNA快速制备试剂盒上海华舜公司；限制性内切酶ECORI，SACI，高保真LATAQ聚合酶，DNTPS，BUFFER，MGCL2大连宝生物技术公司；丙烯酰胺，双丙烯酰胺，异丙基D硫代半乳糖苷IPTG，完全弗氏佐剂CFA和不完全弗氏佐剂IFA美国SIGMA公司；DNAMARKER上海生工公司；GOATANTIMOUSEIGGHRPHL和3二氨基苯联胺DAB3北京中杉公司；咪唑，NACL和TRIS碱美国BBI公司；HISBINDCOLUMNNINTA镍柱美国NOVAGEN公司仪器热循环仪（TMBIORADPCR，美国GENECYCLE公司）；电泳仪（POWER/PAC200，美国BIORAD公司）动物BALB/C小鼠，雌性，810WK龄，体质量1820G（重庆医科大学实验动物中心）方法聚合酶链反应PCR扩增目的基因将12株SPN在CY培养基中增菌至对数生长中后期，按试剂操作说明书分别提取基因组DNA，扩增CLPP的开放读码框架591BP上游引物5CGAATTCATGATTCCTGTAGTTAT3，含ECORI位精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创4/11点；下游引物5CGAGCTCTTAGTTCAATGAATTGTTG3，含SACI位点，引物由上海生工生物技术公司合成使用LATAQ高保真DNA聚合酶，以不同型SPN基因组DNA为模板进行扩增PCR体系DDH2OL，5BUFFER含MG2L，DNTP10MMOL/LL，P15PMOL/L3L，P25PMOL/L3L，SPNDNAL，LATAQL在PCR仪上按下列条件进行扩增95预热5MIN后反应30个周期941MIN，531MIN，721MIN末轮后72延伸5MIN取5L反应产物置10G/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，DNA胶回收试剂盒回收PCR产物克隆载体的构建与鉴定将回收纯化的12个PCR产物克隆至PMD18T载体，转入DH5感受态细胞，在AMPLB平板上培养得到多个阳性克隆，单个阳性克隆细菌经增菌后进行质粒抽提后双酶切鉴定，并将质粒送往重庆医科大学感染实验室做双向测序序列比对与氨基酸序列预测利用DNASSIST软件，将12个重组克隆质粒双向测序的结果及预测的氨基酸序列与GENBANK数据库对已公布的TIGR4SPN全基因组序列进行相似性分析抗原表位预测用抗原表位预测工具ANTIGENICPREDICTEDANTIGENICPEPTIDES分析不同血清型SPNCLPP蛋白的抗原精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创5/11表位及其氨基酸组成CLPP重组载体的诱导表达及纯化原核表达系统PET32A/CLPPBL21DE3在终浓度1MMOL/LIPTG，37，250R/MIN条件下诱导目的重组蛋白CLPP的表达收集的菌体超声波碎菌后，采用NINTA柱纯化目的蛋白，以SDSPAGE和BIORAD凝胶图像分析系统检查目的重组蛋白表达与提纯效果将透析除盐的纯化蛋白溶液经BRADFORD法定量后备用CLPP抗血清的制备稀释后重组CLPP蛋白溶液与等体积的CFA或IFA充分混匀成乳状，在小鼠腹腔下接种制备好的抗原蛋白初次免疫时小鼠接受含200L含重组蛋白10G的CFA与重组蛋白混合物；小鼠再次与末次免疫时接受200L含重组蛋白10G的IFA与重组蛋白混合物小鼠经3次免疫后，分离小鼠血清，并用ELISA法测其ANTICLPP抗体效价BLOT检测将12株SPN在CY培养基中增菌至对数生长中后期（A620NM左右），各取2ML菌液离心取沉淀沉淀用PBS洗3次，用1上样BUFFER处理后，于100水浴5MIN全菌裂解物经SDSPAGE电泳分离后转膜以ANTICLPP多克隆抗体为一抗（1400，羊抗鼠HRPIGG为二抗（15000），DAB为显色底物，WESTERN精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创6/11BLOT检测菌体中CLPP蛋白的表达，以金黄色葡萄球菌作为对照2结果目的基因PCR产物12株细菌的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，可见清晰的扩增条带，产量高，所有PCR产物的分子大小一致，都位于600BP左右图1克隆载体的构建与鉴定将12个重组克隆质粒双酶切后，经10G/L的琼脂糖凝胶电泳，于期望位置上出现目的条带图2，证明CLPP开放读码框架正确克隆入PMD18T载体，同时菌落PCR结果也证明基因克隆正确测序结果与序列比对不同株的CLPP基因编码区大小与TIGR4菌株中CLPP基因一样，均为591BP，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，编码196个氨基酸，基因序列一致性超过99由于遗传密码子的简并性，预测的氨基酸序列一致性则为以上经生物学信息软件分析结果显示，SEROTYPE4，5，6B三菌株CLPP氨基酸序列与TIGR4菌株CLPP氨基酸序列仅存在着一个氨基酸的差异，SEROTYPE1SPN与TIGR4菌株CLPP氨基酸序列仅存在着两个氨基酸的差异，其余血清型与TIGR4菌株CLPP氨基酸序列完全一致抗原表位分析结果12株SPNCLPP蛋白的抗原表位数目相同（分别含7个抗原表位）并且氨基酸组成及分布完全一致精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创7/11融合蛋白及其ANTICLPP抗体效价转化菌经IPTG诱导后，较未诱导菌有一条明显增粗的蛋白条带，MR约为42103左右，与期望值相符合（CLPP蛋白约为MR21103，再加上MR21103左右的硫氧还蛋白）蛋白溶液经镍离子柱亲和层析后透析，SDSPAGE证明纯化产物为单一蛋白，纯度达90该蛋白免疫小鼠后用ELISA法测得的血清效价为168000（图3）蛋白的表达SPN全菌裂解物经电泳分离后，与制备的ANTICLPP血清反应，12型SPN全菌裂解物MR均在21103的位置出现特异性反应条带，而阴性对照未见反应条带出现图4提示不同血清型SPN中均有CLPP蛋白抗原的表达3讨论蛋白疫苗是SPN的第三代疫苗目前认为理想的SPN蛋白质疫苗的标准应包括能在细胞壁表达或者以分泌方式表达、在人体内抗原性高、能诱导杀菌的抗体和具有高度的保守性随着基因组学与蛋白组学的发展，SPN毒力相关蛋白候选疫苗不断地被筛选出来但是一些蛋白由于等位基因的变异57，针对于该蛋白的抗体升高不能识别其等位基因变异的表达产物，从而不能诱导针对不同血清型菌株广泛的免疫保护因此，候选疫苗是否具有诱导高水平、能精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创8/11与不同种类的型或亚型菌株起交叉反应的抗体的能力，是很多致力于SPN疫苗的专家不断寻找高保守蛋白疫苗的原因89我们要评价CLPP候选蛋白疫苗的价值就应考虑其在不同血清型SPN的保守性，并考虑CLPP是否在SPN菌体中表达本研究选用分离自不同标本并且在中国比较常见的1012株不同血清型SPN进行研究，结果发现，在12株菌中CLPP基因相当保守，其抗原表位氨基酸组成以及分布完全一致，无抗原位点的突变，而且12株SPN菌体蛋白中都有CLPP蛋白的表达我们的结果初步表明CLPP在不同血清型SPN中高度保守，在不同型菌体中都有表达细胞壁表达的高保守性蛋白是首选的疫苗靶点目前研究较多的几个SPN蛋白质疫苗如PSPA11，PSPC6和PLY12等，PSPA和PSPC虽在细胞壁表达，但由于等位基因变异，保守性相对较差；PLY虽具有较高的保守性，但在细胞内表达，其抗体难以透过细胞壁与之结合，疫苗保护效果难以得到保证而CLPP在SPN热休克后从细胞内向细胞壁易位3，同时具有高度的保守性，因此它是SPN很好的疫苗靶点，将其单独使用或与其他的蛋白疫苗组合使用，可能会使SPN蛋白疫苗的研究取得突破性进展，从而为我们自主开发广保护范围的SPN疫苗提供理论基础另外我们也采用了BLAST方法分析了SPNCLPP与邻近种属精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创9/11细菌CLPP基因序列的相似性，发现SPNCLPP与许多其它种属细菌的CLPP基因序列具有高度的同源性，比如SPN的CLPP与唾液酸链球菌CLPP的预测氨基酸序列相似程度为8788，与无乳链球菌CLPP的预测氨基酸序列相似程度为9192CLPP可能在这些菌属中存在相同的抗原表位，并可能诱发交叉反应，这应该引起注意总之，在大规模人类免疫接种前对这类高保守蛋白进行彻底的安全性调查，将是非常必要的【参考文献】1BOGAERTD,HERMANSPW,ADRIANPV,ETALPNEUMOCOCCALVACCINESANUPDATEONCURRENTSTRATEGIESJVACCINE,2004,22220922202YUAY,HOURYWACLPPADISTINCTIVEFAMILYOFCYLINDRICALENERGYDEPENDENTSERINEPROTEASESJFEBSLETT,2007,581374937573KWONHY,OGUNNIYIAD,CHOIMH,ETALTHECLPPPROTEASEOFSTREPTOCOCCUSPNEUMONIAEMODULATESVIRULENCEGENEEXPRESSIONANDPROTECTSAGAINSTFATALPNEUMOCOCCALCHALLENGEJINFECTIMMUN,2004,72564656534BUTLERSM,FESTARA,PEARCEMJ,ETAL精品文档2016全新精品资料全新公文范文全程指导写作独家原创10/11SELFCOMPARTMENTALIZEDBACTERIALPROTEASESANDPATHOGENESISJMOLMICROBIOL,2006,605535625MOSCOSOM,OBREGONV,LOPEZR,ETALALLELICVARIATIONOFPOLYMORPHICLOCUSLYTB,ENCODINGACHOLINEBINDINGPROTEIN,FROMSTREPTOCOCCIOFTHEMITISGROUPJAPPLENVIRONMICROBIOL,2005,71870687136IANNELLIF,OGGIONIMR,POZZIGALLELICVARIATIONINTHEHIGHLYPOLYMORPHICLOCUSPSPCOFSTREPTOCOCCUSPNEUMONIAEJGENE,2002,28463717HOLLINGSHEADSK,BECKERR,BRILESDEDIVERSITYOFPSPAMOSAICGENESANDEVIDENCEFORPASTRECOMBINATIONINSTREPTOCOCCUSPNEUMONIAEJINFECTIMMUN,2000,68588959008BAROCCHIMA,CENSINIS,RAPPUOLIRVACCINESINTHEERAOFGENOMICSTHEPNEUMOCOCCALCHALLENGEJVACCINE,2007,25296329