DB51T 1185-2011 桑蚕微粒子病诊断技术规程

47 川省 地 方 标 准 1/T 1185 2011 桑蚕微粒子病诊断技术规程 2011 - 01布 2011 - 03施 四川省质量 技术 监督局 发布 1185 2011 I 前 言 本标准按照 出的规则起草。 本标准由 四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局发布。 本标准起草单位：四川省蚕业管理总站、 四川省农业科学院生物技术 核技术研究所。 本标准主要起草人： 吴 钢、 蔡平钟、朱洪顺、谢忠良、张学清、马露芸。 1185 2011 1 桑蚕微粒子病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了四川省桑蚕微粒子病诊断技术要求。 本标准适用于四川省桑蚕微粒子病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 6682 分析实验室用水规格和试验方法 20395 桑蚕微粒子病病原鉴定方法 844 桑蚕微粒子病防治技术规程 3 试剂 盐酸 w(30 。 氧化钾溶液 w(2 。 氧化氢溶液 w(10 。 析用水按 6682 规定执行。 4 仪器、设备 通光学显微镜、 相衬（ 相差 ） 显微镜，放大倍数 1540 倍或 1640 倍； 生化培养箱（温控范围10 50 ）、冰箱； 天平（感量： 0.1 g） 、 离心机 。 心管、无纺布滤纸 ； 载玻片、盖玻片、测 微尺 ；容量瓶、 量筒、烧杯、二重皿 ； 乳钵、乳棒 ；解剖剪、镊子、橡皮吸管 ； 样品袋、冻存管（ 1.8 5 。 5 诊断 眼诊断 观观察 通过肉眼观察 ， 蚕 的 不同发育阶段 是否具有下列症状 ： a) 小蚕期：收蚁后不疏毛、体色深暗、体躯瘦小、发育缓慢、重症死亡；群体发育不齐。 1185 2011 2 b) 大蚕期：表皮缩皱、体呈锈色；体壁出现微细不规则黑褐色病斑，以尾角末端、气门周围和胸腹足外侧部位较多；蜕皮困难，严重死亡；群体发育不齐。 c) 蛹蛾期：蛹表皮无光泽、反应迟钝、腹部松弛，体壁出现微细不规则黑褐色病斑， 感病 严重 的不化蛾、死亡；蛾羽化展翅不 良、鳞毛脱落、腹部膨大、节间松 弛，交配能力差，产卵少 。 d) 卵期：卵形不正 ， 排列不齐、 多重叠卵，卵产附差、易脱落，不受精卵和死卵多 ； 催青期 发育不整齐。 剖观察 将外观观察的具有上述大蚕期典型病症的病蚕 ，用解剖剪从背中线剪开，肉眼观察丝腺是否有 乳白色脓疱状斑块。 定 通过 外观 观察， 蚕 的 不同发育阶段 出现 述症状 之一的 ，可疑似为蚕微粒子病； 通过解剖观察，大蚕期病蚕丝腺出现可见的乳白色脓疱状斑块时，可确诊 为 蚕微粒子病。 微镜诊断 品采集 采集 述 的典型症状 蚕、蛹、蛾、卵。 采集 的样品置于样品袋 或冻存管中，做好记载。 品处置 样品保存 采集的样品 每份混合均匀后再分成 2 份，其中 1 份作为检样 按照 备检验 ， 另 1 份作为备样， 保存于 0 4 冰箱中， 保存期 30 d 60 d。 样本 制备 不同发育时期的 样 品 ，按照下列方法制样： a) 蚁蚕样品置生化培养箱 于 温度 29 、相对湿度 85 %条件下 ，放置 2 d 3 d。 b) 小蚕期、大蚕期 、 蛹期 、 蛾期 样品 置生化培养箱 于 温度 29 32 、相对湿度 85 条件下，放置 2 d 5 d；大蚕期、蛹期经高温处置的样品，可用解剖剪沿背中线剪开，摘取其 中肠 ，每1 头 5 头蚕或 1 粒 2 粒蛹的中肠为 1 个样。 c) 卵期 样品解除滞育后，在 生化培养箱 温度 29 、相对湿度 85 的条件下催青； 孵化后待其自然死亡。 将上述制备的样本 每份分别置于 1 个乳钵孔中，每孔各放 1 个乳棒，磨碎；滴入 4 滴 10滴氢氧化钾溶液 w( 2 ，再次研细。 按照乳钵序号 ， 将磨碎液用乳棒点样至载玻片，盖上盖玻片，制成镜检样 本。 微镜检 查 直接观察法 将镜检样 本，置于显微镜（ 1540 倍 或 1640 倍 ）下观察，每个样本观察不少于 20 个视野，观察有无微粒子孢子。 1185 2011 3 离心沉淀法 将 备的 磨碎液，用无纺布滤纸 过滤后， 将滤液移入离心管中，经 3000 r/心 3 去上清夜，沉淀物振荡制镜检样 本，置于显微镜（ 1540 倍 或 1640 倍 ）下观察 ，每个样本观察不少于 20 个视野 ， 观察有无微粒子孢子 。 溶解法 将检出有微粒子孢子的磨碎液吸取 2 滴，分别滴于载玻片两端，自然干燥后在其中 1 点加 1 滴 浓盐酸 w(30 ， 另 1 点作对照，在 30 生化培养箱中放置 10 20 ， 盖上盖玻片镜检（ 1540倍 或 1640 倍 ）。如果样本 已干，可加无菌水 1 滴。经过酸处理的样本 ，微粒子孢子溶解消失，真菌孢子保持原状。 氧化氢法 将 检出有微粒子孢子原液吸取 1 滴，滴于载玻片上，再将过氧化氢溶液w(10 1 滴 2 滴滴于孢子液中，盖上盖玻片，经过 10 30 相衬（ 相差 ） 显微镜 镜检（ 1540 倍 或 1640 倍 ），活微粒子孢子释放出极丝。 定 当镜检发现孢子呈长卵圆形 ，大小为 m m m m，呈淡绿色，折光性强，中间隐约可见 1根黑色线状物，表面光滑，孢子活泼，多左右摆动，有时可见翻滚现