DB51T 1207-2011 桑蚕血液型脓病诊断技术规程

47 川省 地 方 标 准 1/T 1207 2011 桑蚕血液型脓病诊断技术规程 2011 - 01布 2011 - 03施 四川省质量 技术 监督局 发布 1207 2011 I 前 言 本标准按照 2009给出的规则起草。 本标准由四川省农业厅提出并归口 。 本标准由四川省质量技术监督局发布。 本标准起草单位：四川省蚕业管理总站、四川省农科院生物技术核技术研究所。 本标准主要起草人： 马露芸 、吴钢、蔡平钟、朱洪顺、谢忠良、张学清。 1207 2011 1 桑蚕血液型脓病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了四川省桑蚕血液型脓病诊断的技术要求。 本标准适用于四川省桑蚕血液型脓病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 核型多角体 桑蚕血细胞和体腔内各种组织感染细胞的细胞核中产生的包含和保护病毒粒子的一种蛋白质结晶体，多呈比较整齐的六角形。 质型多角体 桑蚕中肠感染细胞的细胞质中产生的包含和保护病毒粒子的一种蛋白质结晶体，多为六角形，或有四角形，偶有三角形。 血液型脓病 (核型多角体病 ) 毒寄生在桑蚕血细胞和体腔内各种组织 细胞，使 其血液浑浊 呈 乳白的蚕病 ；并在细胞核中形成多角体，又称核型多角体病。 4 试剂 宁 甲基绿染液 焦宁 w(5 15.5 基绿 w(2 10 无菌水 250 1207 2011 2 酸缓冲液 用前将 A、 丹 染色剂 溶于 100 5%乙醇中， 过滤后， 加入少许甘油 。 氧化钾溶液 w(2 。 酸 溶液 c(1。 学纯 乙醇（ 。 学纯 乙醚 （ 。 析用水按 6682 规定执行。 5 仪器、设备 通光学显微镜、相差 显微镜， 放大倍数 1540 倍或 1640 倍 ； 恒温培养箱 （ 5 65 ）、冰箱； 天平（感量 。 玻片 、 盖玻片 ； 乳钵、乳棒 ；解剖剪、镊子、吸管； 量筒 、 烧杯 ； 样品袋、冻存管 （ 。 6 诊断 眼诊断 观观察 肉眼观察蚕 在 不同发育阶段 是否具有下列症状。 a) 不眠蚕：发生于各龄 眠期 。 体色乳白，体躯肿胀 ， 狂躁爬行，体壁发亮，皮破流脓。 b) 起节蚕： 发生于各龄眠起时。 生长停滞，体色乳白 ； 体壁松弛，体躯缩小 ； 前节的节间膜向后套叠。 c) 斑蚕： 发生于 3 龄 5 龄。焦脚蚕、黑气门蚕 、 焦脚和黑气门同时出现的对称性斑蚕。 d) 高节蚕： 发生于 4、 5 龄盛食期 。各环节间膜或各环节后半部 靠近节间膜处隆起，形如竹节。 e) 脓蚕： 发生 于 5 龄后 期至上蔟前 。环节 肿大 ，体壁发亮，体色乳白 ； 爬行缓慢 ， 皮破 流脓。迟发病蚕死于蔟中或结薄皮茧 后 死亡。 f) 病蛹： 5 龄后期感染，部分能营茧化蛹。病蛹体色暗褐，体壁易破 。 剖观察 将外观观察的具有上述病症的病蚕，用解剖剪剪去尾角或腹足，观察滴出的血液颜色。 定 通过 外观观察，不同发育阶段的蚕出现 述的症状之一时，可初步诊断 为 血液型脓病；通过解剖观察， 滴出的血液呈乳白色浓汁 ，可诊 断 为 血液型脓病 。 1207 2011 3 微镜诊断 品采集 采集 述的典型症状蚕、蛹。采集的样品置于样品袋或冻存管中，做好记载。 品处置 品保存 样品每份混合均匀后再分成 2 份， 其中 1 份作为检样 制备检验，另 1 份作为备样， 保存于 0 4 冰箱中。保存期 30d 60d。 本制备 用解剖剪剪去未病死蚕的尾角或腹足， 制成血液样本 。 病死蚕或蛹置于乳钵中，采取整头（粒）研磨的方法， 加入 4 滴 10 滴氢氧化钾溶液 w( 2 ，用乳棒研细 ，制成磨碎液样本 。 微镜检查 接观察法 取待检样本一滴涂抹于载玻片上，盖上盖玻片，分别置于显微镜（ 1540 倍或 1640 倍 ）下观察，每个样本观察不少于 20 个视野，观察有无多角体。 角体与脂肪球鉴别 丹染色法 取待鉴样本一滴涂抹于载玻片上，自然干燥后， 加 一滴 苏丹 染色剂， 5肪球呈红色或橙黄色，多角体不着色。 机溶剂溶解法 取待鉴样本一滴涂抹于载玻片上，自然 干燥后，加一滴乙醇乙醚的等量混合 液 。待混合液蒸发后，加 无菌 水一滴，盖 上 盖玻片镜检 ， 脂肪球 溶解消失，多角体 存在。 型多角体和质型多角体鉴别 用焦宁 甲基绿染色法。 经 别有 多角体存在的磨碎液样本 ，取 1 滴涂抹于载玻片上， 自然 干燥后， 用吸管滴 1 滴 2 滴盐酸溶液 c(1，在室温下放置 1 2 ，移入 60 恒温箱中放置 1 5 出 用 少量 无菌水 冲洗，加一滴焦宁 甲基绿染色液，常温下染色 1 5 用 少量 无菌水 冲去浮液，镜检 ， 核型多角体呈绿色，质型多角体呈红色。 定 血液样本 经 镜检发现多角体存在，呈六角形 、大小均匀、 折光性较强时， 原样品 确诊为桑蚕血液型脓病