DB51T 1210-2011 马铃薯X病毒检验鉴定技术规程

16 川省 地 方 标 准 1/T 1210 2011 马铃薯 X 病毒检 验 鉴定技术规程 2011 - 01布 2011 - 03施 四川省质量 技术 监督局 发布 1210 2011 I 目 次 前言 . 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 原理 . 1 5 试剂与材料 . 1 6 仪器及用具 . 3 7 取样 . 3 8 实验室检验 . 3 9 结果判定 . 4 10 样品保存 . 4 附录 A（资料性附录） 马铃薯 X 病毒基本信息 . 5 附录 B（资料性附录） 马铃薯 X 病毒 验程序 . 6 附录 C（资料性附录） 马铃薯 X 病毒 验程序 . 8 1210 2011 言 本标准分为范围、 规范性引用文件 、 术语和定义、原理、试剂与材料、仪器及用具、取样、实验室检验、结果判断、样品保存等部分。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：四川省植物检疫站。 本标准主要起草人：宁红、郭迪金、谭家兴、谢成伦、万佳、熊玉兰、杨重渝 1210 2011 I 马铃薯 X 病毒检验鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了马铃薯 （见附录 A）的取样、 实验室检验、 结果判断及样品保存的 技术要求 和方法 。 本标准适用于马铃薯感染 马铃薯 检验和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 业植物调运检疫规程 868铃薯卷叶病毒、马铃薯 病毒检验鉴定技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 目标条带 据某种病毒 异的碱基序列设计特异引物，通过 到的与引物设计长度吻合的 标条带的存在，是判断某种病毒存在的标准。 本标准中 标条带 为 625 注：改写 868义 4 原理 马铃薯 间通过蚜虫和农事操作进行传播，远距离主要通过人为的引种、商品流通等 途径 传播，带毒块茎和种苗是该病毒 远距离 传播的主要载体， 该 病毒具有潜隐性， 根据病害症状很难确定马铃薯 薯块上一般不表现症状。 采用免疫学 和分子生物学方法，可快速根据有关判断标准进行马铃薯 鉴定 。 5 试剂与材料 除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 疫学检验试剂 免疫学检验试剂 包括： 1210 2011 捕捉抗体（ 马铃薯 X 病毒免疫球蛋白，抗体稀释度按市售产品要求进行。贮藏于 4条件下备用； 酶标抗体（ 用碱性磷酸酶标记的马铃薯 X 病毒的免疫球蛋白抗体。按市售产品要求进行稀释，贮藏于 4 条件下备用； 包被缓冲液（ 取 g 碳酸氢钠（ g 碳酸钠（ 0.2 g 叠氮化钠（ 用 1000 馏水溶解，并调 到 藏于 4条件下备用； 洗涤液 (取 g 无水磷酸氢二钠（ 0.2 g 氯化钾（ 0.2 、 8.0 g 氯化钠（ 0.5 g 吐温 20 ，用 1000 馏水溶解，并调整 到 样品提取液（ 取 1.3 g 无水硫酸钠（ 20.0 g 聚乙烯吡咯烷酮（ 4 0.2 g 叠氮化钠（ 2.0 g 级鸡蛋清白蛋白粉、 20.0 g 吐温 20，用 1000 调整 到 藏于 4条件下备用； 酶标抗体稀释缓冲液（ 取 0.2 g 牛血清白蛋白（或脱脂奶粉）、 2.0 g 聚乙烯吡咯烷酮（ n）、 g 叠氮化钠（ 用 100 涤缓冲液溶解，并调整 到 藏于 4条件下备用； 底物缓冲液（ 用 80 菌蒸馏水将 g 氯化镁（ g 叠氮化钠（ 9.7 己醇胺 解后，用盐酸调 到 容到 100 藏于 4条件下备用； 底物溶液（ 将 5 硝基苯磷酸盐（ 解于 5 物缓冲液中。底物溶液制备需在孵育结束前 15 ，避光条件下制备； 终止液 12 g 氢氧化钠（ 于 100 馏水。 验试剂 验试剂 包括： 莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶 （ 100 U/l； 1 冲液 40 20 2冰醋酸调 5 冲液（ 5x 50 100 0.1 10 50%甘油； 10 冲液 100 500 5 抑制剂（ 10 U/ l； 强剂 （ ； 无水乙醇（ ； 解液 ； 去蛋白液 ； ； 0 漂洗液 ； 双蒸水 （ ； 2 液氮 （ ； 引物 游引物（ 基序列 : 5 游引物（ 基序列 ： 5 用双蒸水稀释至 20 M； 1210 2011 100NA 1500 溴酚蓝（ 琼脂糖凝胶： 称取 1.5 g 琼脂糖缓缓倒入 250 角瓶内，加入 100 微波炉中加热 1 解后，再加入 5 L 生物染料，倒入调平并安放适当梳齿的制胶板上 ，冷凝后小心拔出梳齿。 6 仪器及用具 仪器及用具包括： 聚乙烯微量滴定板 根据样品数量选用 40孔和 96孔两种规格 ； 移液器 2 L 10 L、 10 L 50 L、 10 L 200 L、 200 L 1000 5 天平 1/100 g， 1/1000 g； 培养箱 ； 台式高速离心机 ； 酶联免疫检测仪 ； 水平电泳仪 ； 凝胶成像系统 ； 研钵 内径 60 80 剪刀 ； 冰箱 ； 超低温冰箱； 过滤柱 涡旋混匀器 7 取样 株取样 取样方法按 868868 薯（块茎）取样 按 8 实验室检验 铃薯 验方法 见 附录 B。 如采用认可的试剂盒，按说明操作。 马铃薯 品的制备与检验 方法见 附录 C。 如采用认可的试剂盒，按说明操作。 1210 2011 结果判定 阴性对照 阳性对照 性对照 倍的前提下， 样品孔 倍 时 ，判定为阳性反应，即样品带 则判定为阴性 反应 ，即样品不带 阴性对照无扩增条带，且阳性对照出现 625前提下 ，样品 定为阳性反应，即样品带 则判定为阴性 反应 ，即样品不带 10 样品保存 经检 验 鉴定后的样品，应在 保存三个月，以备复验、谈判和仲裁，保存期满后，需进行灭活处理。 1210 2011 V A A 附 录 A （资料性附录） 马铃薯 X 病毒基本信 息 类 马铃薯 ， 简称 称马铃薯潜隐病毒或马铃薯轻花叶病毒，是 马铃薯 毒粒体线形，长 480 580 寄主范围广，病毒稀释限点 100000 1000000倍，钝化温度 68 75 ，体外存活期 1年以上。 害 马铃薯 自然条件下主要靠植株不同部位之间直接接触和带病种薯传播。 通常引起花叶症状 ， 某些品种感染轻微或潜伏起来，有的株系可能引起皱缩，某些株系对特定的病毒株系过敏，反应为顶部坏死。马铃薯 害严重的病毒， 也是传播最为广泛的一种病毒，遍布全世界马铃薯种植区，可引起 10%以上的减产， 田间常与其他病毒混和感染导致马铃薯的毁灭性减产。 播途径 田间通过蚜虫和农事操作进行传播，远距离传播主要通过人为的引种、商品流通等，带毒块茎和种苗是该病毒传播的主要载体。 1210 2011 B 附 录 B （资料性附录） 马铃薯 X 病毒 验程序 被抗体 被 向 酶联反应板 每孔加入 100 将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育 4 h 或 4 冰箱过夜。 板 向每个反应孔中加入 200 液，迅速倒出，重复 2次。洗板完成后将酶联板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 样 品制备 将待测样品剪碎，取 0.3 入 1 加入 2 余样品于 冰箱保存备查，在制样时应注意 防止 样品的交叉污染。 样 用移液器将制备好的样品加入酶联反应板孔内，每个样品三次重复，每孔 100L。 设置阳性对照、马铃薯健康组织研磨液阴性对照和包被缓冲液空白对 照 。加样完成后将酶联反应板置于保湿容器中， 室温孵育 2 冰箱 12h。 板 在每个反应 孔加满洗涤液，迅速倒出，再加满洗涤液，静置 3 复 3次。洗板完成后将酶联板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 合酶标抗体 酶标抗体 向酶联反应板每孔加入 100 于保湿容器中室温孵育 2 h。 板 同 色 每孔加入 10025 避光孵育 30 60 阳性对照显色。 1210 2011 止反应 显色后在每孔中加入 50 L 终止液。记录 检测 结果，存档备查。 果 测定和 记录 用酶联检测仪测定 并记录 光 密度值 （ 。 1210 2011 C 附 录 C （资料性附录） 马铃薯 X 病毒 验程序 采用 给出该试剂盒信息是为了方便标准使用者，如果等效产品具有相同效果，则可使用这些等效产品） 提取马铃薯 取 50 100 块需经发芽后切取幼芽），在液氮中迅速研磨成粉末状，转移粉末至预冷的 1.5 入 500 用前按 入 20 L），涡旋剧烈震 荡 5 匀浆液转移至 12000 心 2 5 心吸取上清液至无 离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。缓慢加入上清 液 匀，得到的溶液和沉淀一起转入 12000 掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱 00 12000 废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱 00 W， 12000 废液，将吸附柱放回收集管中，重复漂洗一次。漂洗完后，将吸附柱在 12000 去除残余液体，并在室温下放置片刻。将吸附柱放入一个新的 膜中央加入 50 L 100 温放置 2 2000 到 转录 应体系 表 铃薯 X 病毒 应体系 反应物 模板 2 T RT 入量（ L） 1 序 反转录程序为： 42 ， 50 94 ， 5 4 保存。 应体系 表 应体系 反应物 10 1 P