遗传学实验设计

已知（1）A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用；（2）心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变试通过设计细胞生物学实验明确（1）B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系（2）在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中最后一次实验课交实验设计实验设计1、实验目的1、检测B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系2、B基因表达产物是否参与A药保护心肌细胞免受缺血损伤的过程2、实验步骤（1）心肌缺血细胞造模1、使用大鼠。将大鼠分别称重后，用20乌拉坦进行腹腔注射麻醉，根据体重计算注射剂量。2、将大鼠仰卧固定于手术台上，针形电极插入四肢皮下，连接生物信息采集系统，连续记录肢体II导联心电图，动态观察ECG变化。3、消毒大鼠颈部及胸部皮肤，沿颈部正中切开皮肤，用止血钳钝性分离大鼠皮下组织及左侧甲状腺，小心分开与左颈动脉伴行的迷走神经，沿左颈动脉分别向上和向下分离，以备留置动脉插管。动脉下穿两根细线，一根尽力向左颈动脉远心端放置，然后结扎左颈动脉；另一根朝左颈动脉近心端放置，打一虚结备用。4、将一小镊子柄部放于左颈动脉下，在动脉近心端放置小动脉夹夹闭颈动脉，同时准备好颈动脉导管，用肝素生理盐水充满颈动脉导管。5、左手用镊子柄垫起左颈动脉，右手将颈动脉导管送入左颈动脉。稍稍送入一段距离后，打实备用结。6、右手轻轻捏住打结处，去除动脉夹，左手将颈动脉导管送入约1/3，使导管与压力换能器相连，信号输入生理记录仪，可在显示器观察到动脉压波形。7、继续推送颈动脉导管，在主动脉瓣开启的瞬间迅速将导管插入左心室，当管子进入左室，可见显示器上压力曲线极限迅速下移，出现心室压力波形。沿胸骨左缘第45肋间隙开胸，暴露心脏，小心剪开心包膜，轻轻挤出心脏，在前降支距左心耳约2MM处穿线，以备结扎，再用直径约3MM聚乙烯管穿过结扎线，放置在靠近LAD主干处8、此期间，观察到明显室性心律失常的大鼠予以弃用。用丝线结扎LAD可造成大鼠心脏的急性缺血，ECG上可观察到典型的心肌缺血改变。此缺血期持续30MIN9、30MIN缺血期结束后，松开结扎线，恢复冠状动脉血流，提取细胞（二）检测B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系设立心肌细胞正常组作为对照1、使用QPCR技术，检测心肌细胞缺血损伤MRNA表达量与正常心肌细胞对比，验证B基因在转录水平的具体作用情况是上调抑或下降；若无变化，则B基因与心肌缺血机制无关2、使用WESTERNBLOT电泳心肌细胞缺血损伤中的B基因表达蛋白与正常细胞对比，检测B基因在翻译水平的相关蛋白量上调抑或下降；若无变化，则B基因与心肌缺血机制无关（三）B基因表达产物是否参与A药保护心肌细胞免受缺血损伤的过程法一基因敲除设立两组缺血心肌细胞，一组为对照，另一组将缺血心肌细胞敲除B基因。，对两组细胞同时加以A药干预一段时间，使用凝胶电泳技术查看两组细胞的蛋白量有无变化。若没有变化，则B基因并不参与A药的干预治疗；反之，则参与治疗途径步骤缺陷完全敲除B基因可能影响细胞内其他活动，增加检测结果的额外影响因素造成误差，最好敲除一个特定片段法二若加入A药干预后观测到B基因表达产物下调，设立两个实验组，向（1）其中一组的细胞中转入B基因MIRNA的MIMIC（2）或者使用质粒转染方法，转入B基因，上调相关蛋白量，使用电泳技术观测心肌缺血损失会否恢复原状。若恢复原状，则B基因参与A药的干预治疗；反之，则未参与步骤（1）质粒转染HTTP/WWWDOCINCOM/P440969998HTML（2）MIRNA的MIMIC转染HTTP/WENKUBAIDUCOM/LINKURLVXIZVFHDZABSVHSZEZTFT9ZXG7P6TGGCIND4PFX1V4PWK_COQNGIKGKDBLFLET8HGMRUKI0XKXPIERG69K6WGC8TDCLFBFKBOVTSXQBWBJY法三若加入A药干预一段后观测到B基因表达产物上调，设立两个实验组，向其中一组（1）通过SIRNA转入抑制剂（2）或者敷相应抗体减少B基因产物，观测下调后的B基因产物会否是心肌缺血损伤复原。若复原，则B基因参与A药的干预治疗；反之，则未参与另检测B基因对细胞影响时，除了用WESTERN技术定量测B基因表达相关蛋白量之外，还可以检测凋亡相关基因如BAX等进行观测（具体步骤见PPT，此处不加赘述）。另外线粒体计数、细胞形态观察都可以作为定量的检测指标。上述步骤各有利弊，综合如下，操作简便，对比结果明显NORMAL心肌缺血心肌缺血A药干预心肌缺血（敲除B基因）A药干预1、培养4组细胞，假设为293T，一组正常对照，三组取自缺血造模后细胞，分为1、2、3、4（1组NORMAL）组3使用A药干预；组4通过质粒转染敲除B基因2、干预相同时间（24小时）之后回收刮下细胞，提取蛋白，使用凝胶电泳，检测B基因调控蛋白结果如下1、组2与组1对比，倘若心肌缺血组B基因相关蛋白量上调，则心肌缺血使得B