细胞命运的转录后调控 译文

原文CELLFATEDETERMINATIONBYUBIQUITINDEPENDENTREGULATIONOFTRANSLATIONDOI101038/NATURE14978译文细胞命运的转录后调控ACHIMWERNER,SHINTAROIWASAKI,COLLEENAMCGOURTY,SOFIAMEDINARUIZ,NIATEERIKORPI,INDROFEDRIGO,NICHOLASTINGOLIAMICHAELRAPE摘要多细胞动物的发育依赖分化程序的准确执行。它使多能干细胞选择特定的细胞命运。现在已经了解到分化需要染色质结构和基因调控网络发生改变，但我们对是否有其他的事件帮助决定细胞命运还知之甚少。在此我们确定了泛素连接酶CUL3及其脊椎动物特异性底物受体KBTBD8（CUL3KBTBD8）在人类和热带爪蟾神经嵴特化中重要的调节作用。CUL3KBTBD8会使得NOLC1及其同源的TCOF1单泛肽化。它们的突变在特雷彻柯林斯综合征中有很大影响。泛素化使得TCOF1NOCL1平台形成。这种物质能将核糖体修饰酶与RNA聚合酶1连接起来进而重组细胞分化的翻译程序以便于神经嵴的特化。由此我们得出结论依赖泛素调节翻译是细胞命运决定的重要特征。CULLINRING连接酶家族（CRLS）是泛素化酶中的最大的一类，在多细胞动物的发育中扮演着重要的角色。CRLS通过大约300个受体蛋白识别他们的底物。其中有些在发育过程中表达会有差异。虽然已经了解到CRL的受体相关基因的突变与人类疾病有联系，但人们没有确切的了解CRLS如何保证细胞分化为特定的类型。为了研究CRLS在发育中所起的重要作用，我们对分化的人类胚胎干细胞（HESCS）采用了全基因组转录分析。定量反转录PCR（QRTPCR）测定KBTBDMRNA与蛋白印迹分析测定蛋白量显示，在HESC分化过程中脊椎动物特异性CUL3受体KBTBD8的丰度大量减少。结果显示，在HESCS分化的过程中，脊椎动物特异性CUL3受体KBTBD8会明显减少。KBTBD8在小鼠和热带爪蟾的发育中也会下调，这与进化保护方向一致。KBTBD8的缺失不影响HESCS的细胞周期、存活以及多能性，而是神经嵴特化所必须的，这一点从HESCS的基因表达谱受胚体分化的限制就能看出。QRTPCR实验证实KBTBD8减少了神经嵴标记物的表达，包括FOXD3和SOX10。过程中还伴随着相关的中枢神经系统（CNS）和前脑的前体转录的增加（FOXG1，SIX3）。基于这些观察，我们将HESCS进行双SMAD抑制（神经转换）。这将决定向中枢神经系统前体和神经嵴细胞的分化。从胚体的分化可以看出，KBTBD8的缺失会引起神经嵴细胞的显著减少和中枢神经系统前体的增加，我们发现这是由多种短发夹RNA（SHRNA）造成，并可通过抗SHRNA的KBTBD8恢复。我们在单个细胞分辨率下用大多数神经嵴细胞都能表达的SOX10或AP2神经嵴标志物，P75，HNK1证明了这一点。当神经嵴标志物在对照实验中被检测到时，中枢神经系统前体标志物会在KBTBD8缺失细胞中的积累。由此可见神经嵴细胞分化早期需要KBTBD8。因此KBTBD8对于源于HESC的神经嵴细胞分化为间质细胞、黑素细胞或软骨细胞来说非常重要。在非洲爪蟾细胞中，CUL3KBTBD8的下调或抑制也会阻止胚胎中神经嵴的形成并引起中枢神经系统前体的膨胀。由此可知CUL3KBTBD8调节着控制神经嵴发育的开关，但这只会发生在脊椎动物中。为了分离出CUL3KBTBD8的重要靶点，我们使用COMPPASS质谱分析来捕获结合了野生型但未突变底物结合结构域的KBTBD8的蛋白质（KBTBD8（W579A）。KBTBD8识别同源的NOLC1和TCOF1，构成相互作用网络，但KBTBD8（W579A）不能识别上述物质。通过蛋白印迹分析，我们确定TCOF1和NOLC1与KBTBD8而不是KBTBD8（W579A）结合，并且发现在HESCS的内源性蛋白和体外重组系统中也有同样的反应。泛素结合物的变性纯化显示KBTBD8诱导了稳定的TCOF1和NOLC1的单泛肽化，而KBTBD8W579A与CUL3结合缺陷的KBTBD8Y74A则不行。这些事件需要ARRESTIN作为辅助因子。如果缺失，会使KBTBD8无法识别识别，TCOF1、NOLC1也无法发生单泛肽化。如果只表达KBTBD8W579A或者KBTBD8Y74A的HESCS就会如同缺失KBTBD8一样不能特化出神经嵴，而中枢神经系统前体的丰度增加。如果我们将TCOF1或者NOLC1去除，也同样能看到同样的异常分化，但其他与KBTBD8结合的物质去除不会有这种情况。这表明这些蛋白质是一起产生作用，KBTBD8和TCOF1或NOLC1的共同消耗分别反映了缺少了其中一个的HESCS的分化程序。因此我们得出结论TCOF1和NOLC1是在神经嵴特化过程中CUL3KBTBD8很重要的单泛肽化底物。按照这个观念，TCOF1的突变会造成特雷彻柯林斯综合征（即一种由于颅神经嵴细胞的缺失以颅面部紊乱为特征的疾病）也可以得到解释。为了理解CUL3KBTBD8如何使神经嵴特化，我们使用选择性识别泛素化后的蛋白质以及野生型KBTBD8，无活性的KBTBD8（Y74A）或空载体再造的TCOF1需求细胞进行实验。值得注意的是，我们通过亲和纯化和蛋白印迹分析发现，NOLC1是泛素化TCOF1结合的主要影响因子。单泛肽化使得相互结合的物质更稳定，如果KBTBD8缺失，TCOF1和NOLC1在神经转换的晚期阶段会降解。在这些结果的基础上我们建立了一系列的亲和纯化方案来确定泛素依赖性的TCOF1NOLC1复合物的构成。我们发现，TCOF1NOLC1结合物确保RNA聚合酶1的合成；H/ACA复合物催化RRNA假尿嘧啶化；而SSUPROCESSOM控制核糖体小亚基的成熟和变形。据此断定，CUL3KBTBD8的泛素化促使内源性RNA聚合酶1与SSUPROCESSOM成为复合物。这一过程需要TCOF1和NOLC1。类似的事件也在HESCS中观察到。在HESCS中SSUPROCESSOME与RNA聚合酶1之间的相互作用也会由于KBTBD8的缺失而缺失。因此，CUL3KBTBD8诱发泛素依赖TCOF1NOLC1复合物的形成。复合物平台可以将RNA聚合酶1与负责加工和修饰核糖体的酶连接起来。这些观察结果支持泛素化在神经嵴中的作用，对RNA聚合酶1的突变也会造成特雷彻柯林斯综合征做出了解释。虽然KBTBD8靶点蛋白与核糖体合成有联系，但是他的缺失并不影响RRNA或MRNA编码核糖体蛋白丰度；核糖体蛋白的水平；前体RRNA的表达；核仁的完整性；核糖体小亚基的传输；结合MRNA的核糖体（通过多核糖体梯度分析判断）；球蛋白MRNA翻译（通过代谢标记检测）；和细胞的存活。据此推断，由于雷帕霉素造成的球蛋白翻译减少不会引起和缺失KBTBD8一样的状况。在神经嵴特化时，TCOF1的缺失也不会影响RRNA合成，P53的活性和细胞存活。这虽然与前人的研究结果一致，但是在神经转换的最后阶段，缺失会减少RRNA的水平并会导致细胞死亡。这些观察结果说明KBTBD8和TCOF1决定了神经嵴的分化并且他们的缺失不会影响核糖体的丰度、球蛋白MRNA的翻译和细胞存活。因此我们认为CUL3KBTBD8依赖的核糖体修饰平台可能使得核糖体有了不同的翻译输出。事实上，通过RNA测序和核糖体分析可以看出，KBTBD8的缺失改变了细胞进行神经转换的翻译程序，不过并不影响HESCS中的蛋白质合成。TCOF1缺失也能观测到类似的情况，并且分化时KBTBD或TCOF1缺失的HESCS的翻译效率曲线与之相关。KBTBD8缺失会使细胞在开始分化后立即引起翻译的改变，即分化成神经嵴细胞或中枢神经系统前体之前。对MRNA调节的分析表明，KBTBD8抑制了与分化成中枢神经系统前体相关的蛋白质的生成，而不影响与神经嵴分化有关的MRNA的翻译。从这个角度看，KBTBD8或TCOF1延迟了中枢神经系统前体蛋白的积累直到神经嵴分化开始发生，其中包括ATRX和PCM1。但需要注意的是KBTBD8在翻译控制中的作用，它是使ATRX和PCM1在正确的时间表达，并不限制他们的MRNA表达和蛋白质稳定性。KBTBD8的缺失也会减少编码组蛋白的MRNA的翻译和核糖体的组装，但是考虑到它们的半衰期很长，相关蛋白的水平在我们进行试验的过程中几乎不会减少。因此，应该是依赖CUL3KBTBD8形成的核糖体修饰平台改变了特定MRNA的翻译，从而拖延了中枢神经系统前体蛋白的积累，直到HESCS完成了神经嵴的特化。我们的研究证明了泛素化在分化时改变翻译程序中的重要作用，并明确了CUL3KBTBD8底物以及特雷彻柯林斯综合征相关蛋白TCOF1在神经嵴分化早期的功能。我们推测CUL3KBTBD8和TCOF1可以控制不同修饰核糖体的生成，可能还包括转录后RRNA的假尿苷酸化及甲基化、核糖体蛋白或核糖体相关因子的磷酸化和泛素化。这些修饰可能会影响核糖体与MRNA，运送MRNA给核糖体的特殊因子，控制特定MRNA合成或降解的蛋白的反应。再结合有关核糖体蛋白再分化过程中的特殊功能的研究，我们能得知通过核糖体调节控制的发育开关可能解释了核糖体合成的影响因子的突变能导致组织特异性。如果能操纵这一开关就能找到治疗儿科疾病的策略例如特雷彻柯林斯综合征是由TCOF1的突变导致的，提高剩余的野生型TCOF1基因的KBTBD8依赖型泛素化的效率可能再发生核糖体的调节并形成神经嵴。图例1CUL3KBTBD8驱动神经嵴特化A逐渐消耗KBTBD8的HESCS发生神经转换，通过QRTPCR分析证明BKBTBD8缺失造成神经嵴细胞缺失，通过蛋白印迹分析证明CKBTBD8缺失的HESCS进行神经转换，通过免疫荧光显微镜分析D注射了KBTBD8翻译阻断物质的热带爪蟾胚胎，通过原位杂交分析ECUL3KBTBD8控制的发育开关的模型图例2CUL3KBTBD8使TCOF1和NOLC1泛素化A可信度较高的野生型或突变型KBTBD8的相互作用。左对每个野生型KBTBD8相互作用因子的归一化光谱计数。右描绘与野生型KBTBD8结合的热点图B通过抗FLAG免疫反应沉淀和蛋白印迹分析证明293T细胞中KBTBD8的相互作用CHESCS中KBTBD8的免疫反应沉淀D293T细胞中，在变性NINTA纯化重组KBTBD8变体后HA标记的泛素化的TCOF1E293T细胞中，由CUL3KBTBD8单泛肽化的HANOLC1F293T细胞中，单泛肽化的内源性TCOF1和NOLC1重组的KBTBD8变体及组氨酸泛素（L73P）图例3CUL3KBTBD8通过TCOF1和NOLC1控制神经嵴细胞分化AHESCS经抗SHRNA的KBTBD8变体重组或缺失KBTBD8的相互作用物质后的神经转换。BHESCS神经转化时经抗SHRNA的KBTBD8变体重组后的蛋白表达C一直缺失KBTBD8、TCOF1或NOLC1的HESCS的蛋白表达和神经转换D缺失KBTBD8、TCOF1和NOLC1复合物的HESCS的神经转换，通过QRTPCR分析图例4泛素依赖的TCOF1NOLC1复合物将RNA聚合酶1与核糖体修饰酶连接AKBTBD8或KBTBD8（Y74A）重组的293T细胞中TCOF1的相互作用因子B确认TCOF1NOLC1复合物的形成依赖CUL3KBTBD8C对FLAGTCOF1/HANOLC1复合物的序列免疫沉淀的COMPPASS质谱分析D对KBTBD8依赖的TCOF1NOLC1复合物的顺序亲和纯化的确认EKBTBD8变种的29