blk基因与汉族人系统性红斑狼疮易感性关联性研究

安徽医科大学硕士学位论文BLK基因与汉族人系统性红斑狼疮易感性的关联性研究姓名徐强申请学位级别硕士专业皮肤病与性病学指导教师张学军杨森20100301安徽医科大学硕士学位论文中文摘要BLK基因与汉族人系统性红斑狼疮易感性的关联性研究研究背景系统性红斑狼疮（SLE）是一种临床表现多样化、可累及多个系统的自身免疫性疾病。SLE发病机制尚未明确，是一种多基因复杂疾病，目前认为与遗传、免疫、病毒感染、药物及激素等众多因素有关，其中遗传因素在SLE的发病机制中发挥重要作用。过去二十年，各研究小组主要通过全基因组扫描和候选基因的方法研究SLE的易感基因，但多数结果不尽一致。近年来随着国际单体图型计划（HAPMAP）的完成和廉价高效的高通量基因分型技术的出现，全基因组关联分析（GWAS）已成为寻找复杂疾病易感基因最有效的方法。目前已开展了多个SLE易感基因的GWAS研究。HOM等首先利用ILLUMINA550K芯片进行SLE易感基因的GWA研究，初筛使用欧洲裔北美人群的1,311例病例和3,340例对照，验证阶段选取了瑞典的793例病例和857例对照，发现BLK基因（SNPRS13277113，OR139，P11010）是SLE的易感基因。在香港人群中，也验证了BLK基因的单核酸（SNP）RS13277113（P134105）及RS2248932（P0034）与SLE易感性相关。但SLE是一种复杂疾病，具有较强的种族差异和遗传异质性，为了探讨RS2248932位点是否与汉族人SLE易感性相关，本实验应用SEQUENOMMASSARRAY质谱阵列技术，对中国汉族人SLE患者（1,396人）和健康对照（4,362人）进行BLK基因的SNPRS2248932基因分型，探讨BLK基因多态性与汉族人SLE易感性的相关性。目的验证BLK基因多态性RS2248932与汉族人SLE易感的相关性。4安徽医科大学硕士学位论文方法应用SEQUENOMMASSARRAY质谱阵列技术对1,396例SLE患者和4,362例正常对照样本进行BLK基因单核苷酸多态性（SNP）位点RS2248932基因分型，用PLINK软件对数据资料进行统计分析，包括分层分析。并且进一步通过实时定量逆转录PCR（RTPCR）分析SNP位点RS2248932的变异是否与BLK的表达有关。结果RS2248932（P141108）位点等位基因频率在病例组和正常对照组之间的差异有统计学意义；对病例分层分析，SLE和SLE组别相比较，P值无意义；RS2248932位点与BLK基因MRNA表达有关。结论BLK基因多态性与汉族人SLE易感性相关。关键词系统性红斑狼疮BLK遗传学单核苷酸多态性5安徽医科大学硕士学位论文ABSTRACTTHEASSOCIATIONOFTHEBLKGENEWITHSLEWASREPLICATEDINCHINESEHANBACKGROUNDSYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUSSLEISANAUTOIMMUNEDISEASEWITHVARIOUSCLINICALMANIFESTATIONS,INVOLVINGMULTIPLESYSTEMSTHEPATHOGENESISHASNOTBEENENTIRELYCLEAREDSLEISAPOLYGENICDISEASE,WHICHISRELATEDWITHGENETIC,IMMUNE,VIRALINFECTIONS,DRUGS,HORMONESANDSOONGENETICFACTORMAYPLAYANIMPORTANTROLEINTHEPATHOGENESISOFSLEINTHEPASTTWODECADES,MANYGROUPSHADMAINLYREVEALEDOFSUSCEPTIBILITYGENESBYGENOMEWIDESCANNINGANDCANDIDATEGENESTUDY,BUTMOSTRESULTSWERENOTCONSISTENTINRECENTYEARS,ASTHEINTERNATIONALHAPMAPPROJECTHADFINISHEDANDLOWERCOST,HIGHLYEFFICIENTANDHIGHTHROUGHPUTGENOTYPINGTECHNOLOGIESWEREAPPEARED,THEWAYOFSEARCHINGFORTHESUSCEPTIBILITYGENEOFCOMPLEXITYDISEASEINTHELEVELOFGENOMEWIDEHASBECOMEPOSSIBLEITWASALSOCALLEDGENOMEWIDEASSOCIATIONSTUDYGWASTHISMETHODHASBECOMETHEMOSTEFFECTIVEMETHODTOSTUDYCOMPLEXDISEASESOFAR,THEREAREMANYGWASABOUTSLEHARLEYETALHADFIRSTLYREPORTEDTHATASINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISMSNPRS13277113INBLKGENEWASRELATEDTOSLEINEUROPEANSOR139,P1109THEREWERE1,311CASESAND3,340CONTROLSINTHEFIRSTSTAGEFROMNORTHAMERICA,793CASESAND857CONTROLSINTHESECONDSTAGEFROMSWEDENWYANGETALHADALSOREPLICATEDTHATTHEBLKGENESNPRS13277133P134105ANDRS2248932（P0034）ARERELATEDTOSLESLEISACOMPLEXDISEASE,WITHSTRONGRACIALDIFFERENCESANDGENETICHETEROGENEITYINORDERTOINVESTIGATETHEASSOCIATIONBETWEENRS2248932ANDSLEINCHINESEHANPOPULATION,WEGENOTYPEDSNPRS2248932IN1,3966安徽医科大学硕士学位论文SLEPATIENTSOFCHINESEHANAND4,362ETHNICALLYMATCHEDCONTROLSUBJECTSBYUSINGTHESEQUENOMMASSARRAYSYSTEMANDEXPLOREDTHEASSOCIATIONBETWEENPOLYMORPHISMOFBLKGENEANDSLESUSCEPTIBILITYINCHINESEHANPOPULATIONOBJECTIVETOREPLICATEDTHEASSOCIATIONBETWEENPOLYMORPHISMOFBLKGENEANDSYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUSSLESUSCEPTIBILITYINCHINESEHANPOPULATIONMETHODSWEGENOTYPEDSNPRS2248932IN1,396SLEPATIENTSOFCHINESEHANAND4,362ETHNICALLYMATCHEDCONTROLSUBJECTSBYUSINGTHESEQUENOMMASSARRAYSYSTEM,ANDTHENUSEDTHEPLINKSOFTWAREFORSTATISTICALANALYSISTODETECTWHETHERTHEVARIANTOFTHESNPRS2248932WASASSOCIATEDWITHTHEBLKEXPRESSIONBYQUANTITATIVEREALTIMERTPCRONTOTALRNARESULTSTHEREWERESIGNIFICANTDIFFERENCESBETWEENCASESANDNORMALCONTROLSINALLELEFREQUENCIESOFSINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISMSNPRS2248932INBLKGENEP141108STRATIFIEDANALYSISTHEASSOCIATIONSOFRS2248932INBLKWITHSLEILLUMINATEDTHATCASEONLYANALYSISINOURSTUDYDIDNOTPRODUCEANYSIGNICANTDIFFERENCE（P均005）THEVARIANTOFTHESNPRS2248932WASASSOCIATEDWITHTHEEXPRESSIONOFBLKMRNACONCLUSIONSITSUGGESTSTHATPOLYMORPHISMOFBLKGENEMAYBERELATEDTOSUSCEPTIBILITYOFSLEINCHINESEHANPOPULATIONKEYWORDSYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUS/BLK/GENETICS/SINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISM7安徽医科大学硕士学位论文英文缩略词表缩写词SLEGWASSNPOMIMHLAEDTAMAFLDOR95CIPBMCS英文全称SYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUSGENOMEWIDEASSOCIATIONSTDUYSINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISMONLINEMENDELIANINHERITANCEINMANHUMANLEUKOCYTEANTIGENETHYLENEDIAMINETETRAACETEMINORALLELEFREQUENCYLINKAGEDISEQUILIBRIUMODDSRATIO95CONFIDENCEINTERVALPERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLS中文名称系统性红斑狼疮全基因组关联分析单核苷酸多态性在线人类孟德尔遗传人类白细胞抗原乙二胺四乙酸最小等位基因频率连锁不平衡优势比95可信区间外周血单个核细胞RTPCRREVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAIN逆转录聚合酶链反应REACTIONPCRPOLYMERASECHAINREACTION聚合酶链反应3学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。学位论文作者签名日期学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。愿意将本人的学位论文提交中国博士学位论文全文数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库和中国学位论文全文数据库中全文发表，并可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版，并同意编入CNKI中国知识资源总库，在中国博硕士学位论文评价数据库中使用和在互联网上传播。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名日期导师签名日期。SLE是一种多基因病，目前安徽医科大学硕士学位论文BLK基因与汉族人系统性红斑狼疮易感性的关联性研究硕士研究生徐强导师张学军教授杨森教授1引言系统性红斑狼疮（SYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUS，SLE）是一种临床表现多样化、可累及多个系统的自身免疫性疾病，以出现多种自身抗体、补体激活、免疫复合物沉积、组织和器官的损伤为特征。北欧人发病率约为004，黑人约为021，中国人为00360042，男女患病比例为1934认为与遗传、免疫、病毒感染、药物及激素等因素有关，其中遗传因素在SLE的发病中发挥重要作用5。大多数情况下，SLE的遗传易感性是由人群中相对常见的变化决定，每个位点的变化对疾病的发病风险仅起微效作用，也就是“常见疾病常见变异”的假说6。遗传和环境因素共同作用，导致机体的免疫系统功能紊乱而自身耐受丧失。SLE与特异性免疫和非特异性免疫异常有关，在临床症状出现前也会出现免疫学方面的异常。过去二十年，各研究小组主要通过全基因组扫描和候选基因的方法研究SLE的易感基因，但多数结果不尽一致7。在线人类孟德尔遗传（ONLINEMENDELIANINHERITANCEINMAN，OMIM）数据库收录的18个SLE易感基因位点中有15个是通过连锁分析和全基因组扫描发现的，同时通过精细定位和候选基因的方法发现了8。安徽医科大学硕士学位论文一些可能与SLE相关的易感基因，如PTPN22，CRP，FCGR2A，FCGR3A，FCGR2B，STAT4，IRF5，TLR5，ITGAMITGAX，FAS，PARP，PDCD1，HLADRB1C2，C4等。近年来随着国际单体图型计划（HUMANHAPLOTYPEMAP，HAPMAP）的完成和廉价高效的高通量基因分型技术的出现，全基因组水平搜寻复杂疾病易感基因的方法即全基因组关联分析（GENOMEWIDEASSOCIATIONSTUDY，GWAS）已成为可能。GWAS从人类全基因组范围内的单核苷酸多态性（SINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISM，SNP）中，利用高通量基因分型技术，分析数以万计的SNPS，比较病例组与对照组之间等位基因频率的差异，并分析这些等位基因的变异对疾病发病风险作用的大小，筛选出与疾病性状相关的SNPS，再根据其在基因组中的位置和连锁不平衡（LINKAGEDISEQUILIBRIUM，LD）推测可能存在的疾病易感基因，并且进一步验证这些基因和疾病的关系。迄今为止，利用GWAS对40多种常见疾病和性状进行研究，发现和重复验证了近100个位点8，9GWAS是近年来搜寻复杂疾病的易感基因最有效的方法，目前该方法已发现多个SLE的易感基因或位点，如BANK1、C10ORF64、HLADQA1、TNPO3、PXK、KIAA1542、TNFAIP3、C8ORF13BLK、NTNG2、GHR、SOCS6、NEGR1、1Q251、17P12、4Q283、2P163等。HOM10等首先利用ILLUMINA550K芯片进行SLE易感基因的GWA研究，初筛使用欧洲裔北美人群的1,311例病例和3,340例对照，验证阶段选取了瑞典籍793例病例和857例对照，发现BLK基因（SNPRS13277113，OR139，P11010）是SLE的易感基因。在香港人群中，也验证了BLK基因的单核酸（SNP）RS13277113（P134105）及RS2248932（P0034）与SLE易感性相关11。但SLE是一种复杂疾病，具有较强的种族差异和遗传异质性，为探讨RS2248932位点是否与汉族人SLE易感性相关，本实验应用SEQUENOMMASSARRAY质谱阵列技术，对中国汉族人SLE患者（1,396人）和健康对照（4,362人）进行BLKSNPRS2248932位点基因分型，探讨BLK基因多态性与汉族人SLE易感性的相关性。9安徽医科大学硕士学位论文2实验材料与方法21研究对象本实验所有研究对象均为中国汉族人，而且大部分SLE患者及健康对照者都来自中国中部地区。病例组1,396例（1,279个女性和117个男性），患者平均年龄为3479岁，患者均由至少两名以上皮肤科医师确诊，诊断依据为1997年美国风湿病学会修订的SLE诊断标准12，他们的资料均通过全面的临床检查所得。对照组4,362例正常对照（2,094女性和2,268例男性），均为非SLE、自身免疫性及其他系统性疾病患者，而且其家族成员也无SLE患者（包括一级，二级，三级亲属），平均年龄为3444岁。患者之间、对照之间、患者与对照之间彼此均无亲缘关系。一般情况见表1。表1研究对象一般情况TAB1BASICSTATEOFOBJECTS组别病例正常对照例数1,3964,362平均年龄（岁）34793444男/女117/12792,268/2,09422实验试剂221DNA提取试剂1基因组DNA提取试剂QIAGENDNA抽提试剂盒，包括FG1（细胞裂解缓冲液），FG2（蛋白变性缓冲液），FG3（DNA溶解缓冲液），QIAGEN蛋白酶2异丙醇（蚌埠化学试剂厂）及75乙醇（蚌埠新科电化试剂厂）222电泳试剂1超纯水2TRIS碱及硼酸（上海生工生物工程公司）3TRIS硼酸电泳缓冲液（TBE）浓贮存液（每升），554GTRIS碱，275G硼酸，10安徽医科大学硕士学位论文20ML05MOL/LEDTA（PH80）使用液，050045MOL/LTRIS硼酸，0001MOL/LEDTA4琼脂糖（PROMEGA公司，USA）5溴化乙锭，10MG/ML贮存液（上海生工生物工程公司）223DNA标准化试剂1FG3（DNA溶解缓冲液）及超纯水224基因分型试剂2241PCR反应相关试剂1去离子水2一套05M扩增引物和延伸引物混合物（上海赛百胜基因技术有限公司合成）310XPCR缓冲液（SEQUENOM公司）415MM和25MMMGCL2（SEQUENOM公司）525MMDNTP混合物（SEQUENOM公司）65U/L热启动TAQ酶（SEQUENOM公司）2242制备SAP相关试剂1去离子水2SAP缓冲液（SEQUENOM公司）3SAP酶17U/L（SEQUENOM公司）2243IPLEX延伸相关试剂1去离子水2IPLEX阳性缓冲液（SEQUENOM公司）3IPLEX终止混合物（SEQUENOM公司）4IPLEX延伸引物混合物（SEQUENOM公司）5IPLEX酶（SEQUENOM公司）225淋巴细胞分离试剂1）淋巴细胞分离液（合肥志宏生物技术公司）11安徽医科大学硕士学位论文2）磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）及TRIZOL液（合肥志宏生物技术公司）226RNA提取试剂1）K1622逆转录（RT）试剂盒（合肥志宏生物技术公司）2）异丙醇（蚌埠化学试剂厂）3）75乙醇（蚌埠新科电化试剂厂）4）氯仿（蚌埠新科电化试剂厂）227实时荧光定量RTPCR试剂1）RTPCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）2）TAQMAN探针（大连宝生物工程有限公司）23实验仪器231DNA提取器材1MSIMINISHAKER振荡器（马来西亚）2MICROTEC1542R低温高速离心机（日本）3BS60型电热恒温水浴箱（北京市医疗设备厂）4192型超低温冰箱（80）（三洋公司，日本）5HAIER20冰柜（中国海尔集团公司）6美菱BCD238型冰箱（中国美菱集团公司）70510L、20200L、1001,000LTIP（QUALITYSCIENTIFICPLASTIC，USA）80125L、0550L、50200L、2001,000L移液器（EPPENDORF，GERMANY）915ML离心管（QSP）10EDTAK2（或EDTANA2）抗凝真空管1150ML试管架、摇床（TY80R）232电泳仪器1MSIMINISHAKER振荡器（马来西亚）2MICROTEC1542R低温高速离心机（日本）3TGRADIENTTHERMOCYCLER（BIOMETRA，GERMANY）12安徽医科大学硕士学位论文4DYY型电泳槽（北京市六一仪器厂）5ELECTRONICUVTRANSILLUMINATOR（AAB，USA）6FD201稳压稳流电泳仪（北京通用分析仪器厂）7TN100B型托盘式扭力天平（上海第二天平仪器厂）8TANON3500全自动数码凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）9HAIER20冰柜（中国海尔集团公司）100125L、0510L、20100L、50200L、2001,000L移液器（EPPENDORF，GERMANY）110510L、20200L、1001,000LTIP（QUALITYSCIENTIFICPLASTIC，USA）1205ML、15ML离心管（QSP）233DNA标准化仪器1全波长紫外/可见光扫描分光光度计NANODROP1000（NANODROP公司，USA）2DNA浓缩仪（EPPENDORF，CONCENTRACTOR5301）234基因分型仪器1MASSARRAY系统（SEQUENOM公司）296孔、384孔PCR板托垫34306311型封板膜（PERKINELMER公司）4SEALROLLER滚筒（PERKINELMER公司）5通用型压板机（PERKINELMER公司）6136881D垂直混匀器（FISHER公司）7通用型VBOTTOM洗板机8通用型加样槽及通用型托盘天平9VBOTTOMBIORAD384孔PCR储放板（BIORAD公司）10TF0384型384孔PCR板（ABGENE公司）11移液器单道（0125L、0510L、20100L、50200L、2001,000L），12道（0510L）（BIOTECH公司）13安徽医科大学硕士学位论文1210L、200L、1,000LTIP（AXYGEN公司）1315ML、2MLEP管（AXYGEN公司）235淋巴细胞分离仪器1）MICROTEC1542R低温高速离心机（日本）2）HAIER20冰柜（中国海尔集团公司）3）EDTAK2（或EDTANA2）抗凝真空管4）15ML离心管、15MLEP管及50ML试管架7）1001,000LTIP（QUALITYSCIENTIFICPLASTIC，USA）8）2001,000L移液器（EPPENDORF，GERMANY）236RNA提取仪器1）MICROTEC1542R低温高速离心机（日本）2）HAIER20冰柜（中国海尔集团公司）3）192型超低温冰箱（80）（三洋公司，日本）4）MSIMINISHAKER振荡器（马来西亚）5）BS60型电热恒温水浴箱（北京市医疗设备厂）6）15MLEP管7）02MLEP管8）0510L、20200L、1001,000LTIP（QUALITYSCIENTIFICPLASTIC，USA）9）0125L、0550L、50200L、2001,000L移液器（EPPENDORF，GERMANY）237实时荧光定量RTPCR仪器1）MICROTEC1542R低温高速离心机（日本）2）BS60型电热恒温水浴箱（北京市医疗设备厂）3）192型超低温冰箱（80）（三洋公司，日本）4）HAIER20冰柜（中国海尔集团公司）5）192型超低温冰箱（80）（三洋公司，日本）6）15MLEP管及02MLEP管14安徽医科大学硕士学位论文7）0510L、20200L、1001,000LTIP（QUALITYSCIENTIFICPLASTIC，USA）8）0125L、0550L、50200L、2001,000L移液器（EPPENDORF，GERMANY）24分析软件和电子数据库查询信息1引物设计软件ASSAYDESIGNER302基因分型软件SEQUENOMMASSARRAYSYSTEM3分析和质控软件PLINK1034逆转录引物和探针设计软件PRIMER505美国国立生物技术信息中心HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/PROJECTS/SNP/6网上在线孟德尔遗传HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/OMIM/7GENEBANKHTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/GENEBANK8HAPMAPPROJECTLDDATABASEHTTP/WWWHAPMAPORG/CGIPERL/GBROWSE9SEQUENOM引物合成HTTP/MYSEQUENOMCOM/DEFAULTASPX25实验方法和步骤251基因组DNA的制备2511全血标本和临床资料的采集本研究采用统一设计的SLE遗传流行病学调查表和正常对照调查表，由经过专门培训的流行病学调查员对患者和正常对照进行问卷调查。调查表内容包括一般情况（姓名、性别、年龄等）、发病年龄、有无家族史、发病季节、发病部位等。经调查对象知情同意，采集外周静脉血34ML，放置于5MLEDTANA2抗凝管中，置80冻存。2512基因组DNA提取步骤及注意事项1基因组DNA提取步骤用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒按照产品操作说明书提取样本基因组DNA，步骤如下1细胞解冻将血标本从80冰箱取出，放置在20低温冰箱24小时，再从20低温冰箱取出放置4冰箱解冻24小时。15安徽医科大学硕士学位论文2在20MLEP管边侧贴样本号标签并用透明胶带包裹，同时用记号笔在管盖标明。3吸取10MLFG1于上述管中，取400L血样加入对应EP管中，颠倒混合2030次，直至无血凝块出现，16,000转/分离心4分钟（离心期间配置FG2/QIAGEN蛋白酶混合液，需现配现用）。4小心倾倒上清，吸水纸沥干30秒后加入FG2/QIAGEN蛋白酶溶液200L，每加入一份需立即震荡混匀，直到无细胞团出现，待全部加完后仔细检查是否有裂解不完全的样本。如有，应彻底震荡完全。5短暂离心后，65水浴20分钟，水浴时需将管口1/3左右留在液面以上，以防止加热引起管盖打开，水分等杂质进入管内。6短暂离心后，加入200L异丙醇，上下颠倒数次，可见絮状DNA沉淀，如发现管内有黑绿色团块，需用力摇动，将团块摇成澄清液。716,000转/分离心4分钟，小心倾倒上清，吸水纸沥干30秒，可见管底有白色DNA沉淀。8加入200L75乙醇，小心弹起片状沉淀，16,000转/分离心5分钟。9小心倾倒上清，吸水纸沥干20秒，加入110LFG3，65水浴20分钟，置于摇床上12小时，电泳及测浓度后，置80冻存DNA。2注意事项114MLFG3加入QIAGEN蛋白酶，按照FG2FG3/QIAGEN蛋白酶1001的比例配置混合液。如提取24份样本则需将55MLFG2加入到55LFG3/QIAGEN蛋白酶中，每份再加入200L裂解蛋白。如试剂盒附带QIAGEN蛋白酶用完可购买其他品牌，用FG3配置浓度至20MG/ML待用。该液需现配现用2所有用于提取DNA的耗材需高压消毒，干燥后使用。2513DNA浓度标准化1准确测定每份待标准化样本DNA的浓度。2建立电子表格，在每个96孔板上留有A1，H12的空白对照、A6的板内对照16安徽医科大学硕士学位论文和H6的板间对照。3按照电子表格的顺序，加入已经测定浓度的DNA，如DNA浓度高于1525NG/L则加入适量FG3；如DNA浓度低于1525NG/L，则使用真空浓缩仪浓缩样本DNA，最终使得每一孔浓度均在1525NG/L之间，且OD值在1820之间。4离心后贴上粘性锡箔纸，并用标记笔标上样本板标号、样本类型、来源地等信息。5在平板离心机上，3,000G离心3分钟，存放于20冰柜中备用。252SNP点选择HOM等最先报道了BLK与SLE患病风险的关系，HARLEY等已经证实了BLKSNPRS2248932位点与SLE易感性的相关OR122,P71010，但是在中国香港人群中RS2248932位点与SLE易感性的关联并不是特别显著OR084,P0034。在这里我们选了一个大样本，来验证SNP位点RS2248932与中国汉族人SLE易感性的关联性。253引物设计及合成2531基因序列的获取1在MYSEQUENOM网站中注册成用户。2在NCBI网页（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/PROJECTS/SNP/）中输入该SNP位点的名称RS12023196，按照DBSNPBATCHREPORTOR格式显示。3将SNP点所在序列发送到MYSEQUENOM网站注册的邮箱中。4在MYSEQUENOM网站的TOOLS工具栏中选择GENOTYPING。56789点击RSFORMAT，在BROWSE按钮中选择NCBI网站发送到邮箱的文件。网站对序列的格式化完成后在SENTTO栏中，选择PROXSNP。开始PROXSNP，点击BEGINSTART。上述步骤完成后，在SENTTO栏中选择PREXTEND。开始PROXSNP，点击BEGINSTART。10在产生的结果中，选择OUTPUT，并把文件内容复制在新的TXT文件中。17安徽医科大学硕士学位论文2532结合文献并采用ASSAYDESIGNER30软件进行引物设计1在软件SNPGROUP栏中选择BROWSE按钮，找到上述产生的TXT文件。2在AASSYDESIGN栏中选择SBEMASSEXTEND，并在SBESTOPMIX栏中选择IPLEX，在MULTIPLEXLEVEL中按照实际情况选择不同的反应重数。345SNPCAPTURE，EXTENDPRIMERDESIGN，MASSMULTIPLEXING均选择默认参数。参数设定后，点击RUN。在TXT文件目录相应位置找到产生的引物序列文件，设计的引物序列见表2。表2RS2248932位点引物序列TAB2PRIMERSEQUENCESOFRS2248932项目扩增引物1ST扩增引物2ND延伸引物序列5ACGTTGGATGTCTGCAAACTCCCCTGCTG35ACGTTGGATGCAGTTATGATTCTTTGGCAC35GTTCTGAAACCTCAGTTTG36根据引物序列和样本量计算所需引物特定浓度的体积，提交给上海赛百胜基因技术有限公司进行引物合成。2533引物稀释及注意事项1引物稀释1稀释单管扩增引物至终浓度100M，加入去离子水混合后使得各引物浓度为05M。2稀释单管延伸引物至终浓度500M，加入引物混合后使得各引物浓度为8M、10M、15M。3按照DNA合成产品使用说明计算该条引物分子量、质量数和摩尔数，进而根据所需的浓度计算需加入去离子水的量。2注意事项1将粉末状引物高速离心数秒钟，以免在开启时丢失。18安徽医科大学硕士学位论文2小心打开装引物的管子，加入所需的去离子水。3充分振荡、混匀。43,000转/分离心3分钟。5取出部分使用液置于4备用，余下部分放入20保存。254基因分型2541PCR扩增反应1原理聚合酶链式反应（POLYMERASECHAINREACTION，PCR）用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区域。每个PCR循环，反应混合体系都在模板变性、引物退火和引物延伸三种不同温度下依序温育。该过程可使用一种可编程序的温度热循环仪而达到自动化。2步骤1按照384板配置相关试剂。2已经标化至1525NG/L的样本，1,000G离心3分钟备用。3将各PCR组份溶解后置于冰上备用（注意酶一定要保存在冰上，防止在高温中长时间暴露而失活）。4扩增PCR反应组份。5将上述配好的试剂小心混匀后分在12孔的连排管中，每孔加入混匀试剂148UL。612道移液器吸取混合试剂4L加入到384孔板中，其中H11、H12、P11、P12孔留作对照，其孔中不加入引物，只含其他组份。7每板按照标记好的样本板加入相应的模板，加入体积为1L。8移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。9扩增PCR反应程序94945615MIN20SEC30SEC45CYCLES19安徽医科大学硕士学位论文72721MIN3MIN10配置1琼脂糖凝胶，每排留有25个孔，其中一个作为标记孔，其他加入PCR反应后的产物。11进行电泳，吸取2L上样缓冲液，1LPCR产物，电压110V，电流75MA，40分钟后观察结果，如结果良好可继续SAP反应。2542SAP反应1按照384板配置相关试剂。2将配置好的溶液均匀分配到96孔板中，每孔加入试剂量10L/板。3使用机械臂加入试剂，从96孔板中移液2L到384板的每个孔中。4移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。5SAP反应程序3785440MIN5MIN保存2543延伸反应1按照384板配置相关试剂。2将配置好的溶液均匀分配到96孔板中，每孔加入试剂量10L/板。3使用机械臂加入试剂，从96孔板中移液2L到384孔板的每个孔中。4移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。5延伸反应程序949430SEC5SEC52807245SEC5SEC3MIN保存5CYCLES40CYCLES2544完成去盐，导入ASSAY中，样本表格输入，建板，点样，MASSARRAY分析，20安徽医科大学硕士学位论文质量控制及输出报告等实验工作。1去盐1在384/6MGDIMPLE板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干。2使用LIQUIDHANDLER机器臂在384样本板的每个孔中加16L水。3将384样本板轻轻翻转过来扣在DIMPLE板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中。4将384样本板放置离心机中室温旋转混匀60分钟。2导入ASSAY中1打开TYPER40。2选择ASSAYEDITOR。3右键单击添加一个新的项目。4右键新建项目名称或现有项目的名称并选择进口检测组。5取消SNPGROUP选项，将自动取消设计文件和浏览阵列组（XLS文件）。6可以键入一个新的阵列组ID或默认文件名。7单击导入，然后关闭。8关闭阵列编辑器。3样本表格输入1根据384加样顺序创建样本清单。2打开TYPER40，选择PLATEEDITOR。3单击SAMPLETAB，右键新建样本文件夹。4右键新建样本清单。5打开并浏览创建的样本清单，输入样本组名称，导入完成。4建板1打开TYPER40。2选择PLATEEDITOR。3右键单击添加新用户。21安徽医科大学硕士学位论文4右键单击添加新项目。5右键单击添加板。6板型ID和选择板式。7找到ASSAYTAB。8选中板中需添加的孔，右键单击并选择添加ASSAY。9找到SAMPLETAB，选中板中需添加的孔，右键单击并选择添加SAMPLE。10保存板文件。5点样1离心去盐后的产物4,000转/分离心4分钟，使树脂沉淀。2核查体积A在主菜单中选择TRANSFER。B加载一个METHOD。C设定DISPENSESPEED参数。D选定VOLUMECHECK。E选RUN并且观察体积。F346依据体积调整DISPENSESPEED参数获得合适的体积。在芯片上点样，方法同体积核查步骤。在芯片上点CALIBRANT，注意在METHOD里选中CALIBRANT。MASSARRAY分析1在RT计算机上打开RT程序。2按下COMPACT上的PROBESCOUTPLATEOUT按钮，然后把芯片放到SCOUT板上并放回COMPACT中，然后按PROBEIN按钮。3打开CHIPLINKER并连接CHIP和PLATE。A双击CHIPLINKER。B找到在PLATEEDITOR里建立的板。C选择IPLEX模式。22安徽医科大学硕士学位论文D选择GENOTYPE或者GENOTYPEAREA模式。E选择DISPENSER类型。F输入实验名称。G输入芯片条形码。H选择添加、创建。4把条形码名称输入ACQUIRE中，点击BARCODEREPORT，结果正确后点击AUTORUNSETUPTAB。5CHIP扫描。7质量控制1234打开TYPER40，点击TYPEANALYZER。打开扫描结果。检查质控点。查看ASSAY的得率和分型图。8输出报告1分型图。2分别导出原始的基因分型数据和结合分型图后的基因分型数据。3检查数据文件的完整性和正确性。4将结果保存入相应存储媒介并递交生物信息室分析。255淋巴细胞分离2551全血标本和临床资料的采集本研究采用统一设计的SLE遗传流行病学调查表，由经过专门培训的流行病学调查员对患者和正常对照进行问卷调查。调查表内容包括一般情况（姓名、性别、年龄等）、发病年龄、有无家族史、发病季节、发病部位发病的一般情况等。经调查对象知情同意，采集外周静脉血5ML，放置于5MLEDTANA2抗凝管中。2552淋巴细胞分离步骤1在15ML塑料离心管中预先加入4MLFICOLL淋巴分离液。23安徽医科大学硕士学位论文2小心的将稀释后的血液加到FICOLL淋巴分离液的上面。3室温2600RPM离心20分钟。4取出离心管，小心吸出中间白白的那一层，重悬于5倍体积的PBS中，混匀。5室温2000RPM离心10分钟。6弃去PBS，剩下50UL左右，混匀细胞，加1MLTRIZOL试剂，吸入15MLEP管中；7将EP管放入20冻存。256RNA提取1解冻将装有淋巴细胞的15MLEP从20低温冰箱取出放置4冰箱解冻24小时。2用DEPC水配75的乙醇，放20预冷。2向装有淋巴细胞的15MLEP管加入02ML氯仿，颠倒混匀10下，放室温5分钟，412000G离心15分钟。3另取15MLEP管边侧贴样本号标签并用透明胶带包裹，同时用记号笔在管盖标明。4离心结束后转上层水相（约400L）于对应的15MLEP管中，加等体积异丙醇（约400L），混匀室温10分钟，412000G离心，10分钟。5离心结束后，弃上清加冰预冷的75乙醇1ML，47500G离心，5分钟。6离心结束后弃上清，空气干燥510分钟，加入20LDEPC水，然后60水浴10MIN。7电泳及测浓度后放20备用。257实时荧光定量RTPCR2571CDNA制备步骤1取11L于02MLEP管中，放PCR仪705MIN，然后放置冰上3MIN。2每个EP管中依次加入相应RNA11L，5BUFFER4L,INHIBITOR1L,10MMDNTP混合物2L，MMLV1L，配成2L0放入PCR仪。3扩增PCR反应程序42701H5MIN24安徽医科大学硕士学位论文9542MIN4加入80LDDH2O,20保存CDNA。2572CDNA检测步骤1取02EP管，用记号笔在管盖标明。2每个EP管中依次加入相应CDNA2L，10BUFFER1L,MGCL206L,10MMDNTP混合物16L，上游引物02L，下游引物02L，TAQ酶01L，H2O43L,配成10L体系放入PCR仪。3扩增PCR反应程序94945MIN30SEC557272430SEC1MIN10MIN35CYCLES4配置1琼脂糖凝胶，加入PCR产物电泳。2573逆转录引物和探针的设计1用PRIMER50软件设计引物和探针。2引物和探针均有宝生物公司合成。2574实时荧光定量步骤1取384孔板。2每个孔中依次加入2PREMIXEXTAQTM10L，TNIP1上、下游引物各04L或GAPDH上、下游引物各04L，50ROXREFERENCEDYE04L，TAQMAN探针04L，CDNA1L，DH2O（灭菌蒸馏水）74L，每个样本重复3孔。3PCR反应程序959510SEC10SEC60440SEC40CYCLES25安徽医科大学硕士学位论文4将标准品10倍连续梯度的标准曲线。5测定TNIP1和GAPDH的拷贝数。258统计分析1根据生成的结果和LOG文件，再次检验样本资料，确认无误后进行相应分析，并汇总结果。对数据进行核查，如果有差异，重新检查两次处理的过程；若两个结果一致便形成最终结果。2对数据资料进行质量控制包括计算样本得率、SNP得率、最小等位基因频率（MINORALLELEFREQUENCY，MAF）、HARDYWEINBERG（HWE）平衡。3对质控后的数据用PLINK103分析并输出结果，用COCHRANARMITAGETREND算法计算P值、OR值和95CI。具体步骤见图1。4对质控后的数据用SPSS100进行分析，不同基因分型之间均采用T检验。样本得率99质控后数据SNP得率90用PLINK103软件分析并输出结果最小等位基因频率001COCHRANARMITAGETREND算法计算P值、OR值和95CI，HWE平衡FIG1SPSS100分析图1质量控制与统计分析流程图FLUIDOGRAMOFQUALITYCONTROLANDSTATISTICALANALYSIS26安徽医科大学硕士学位论文3结果BLK基因中的SNP位点RS2248932MAF1,并且符合HWE平衡定律。我们应用SEQUENOMMASSARRAY质谱阵列技术对BLK基因的RS2248932位点基因分型，发现等位基因分布差异具有统计学意义P141108,OR074,95CI066082见表3；同时用ILLUMINAHUMAN610QUAD芯片对117个样本（包括64个病例和53个对照）进行该位点基因分型，这两个平台的基因分型一致率为9915。而且在每一个样板中及各个样板之间都有重复的样本用以质控。对SLE不同临床亚型分层分析，我们观察到主要表现为关节炎、自身抗DSDNA抗体阳性、血液学异常、蝶形红斑及ANA阳性的的患者组和对照组相比，P值均有意义，（P值分别为718106，221107，807106，715106及676109）然而，病例组之间的分析并没有统计学意义P值005见表45。BLKMRNA表达实验，发现等位基因纯合子CC的表达水平大概是纯合子TT表达的30，而杂合子C/T居中，P00004（T检验），说明风险等位基因C与MRNA的低表达相关。见图2表3系统性红斑狼疮患者和对照的RS2248932C/T多态性的等位基因和基因型分布情况TABLE3DISTRIBUTIONOFALLELESANDGENOTYPESFORTHERS2248932C/TPOLYMORPHISMINSYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUSPATIENTSANDINCONTROLS对照N4362病例N1396OR95CIP值等位基因（ALLELE）T64957442227798C2229256565202074066082141108基因型（GENOTYPE）TTCT24125531671383894640439315REFERENCE071062081CC279646345061046081464108RECESSIVEMODELC/CVSC/TT/T279646345069052091001DOMINANTMODELC/CC/TVST/T1950（441）502（36）069061079888109结果符合显性模式OR（优势比）95CI（95置信区间）病例对照，采用22表格病例对照，采用32表格27安徽医科大学硕士学位论文表4不同临床表现的系统性红斑狼疮患者的数量及比例TABLE4COUNTANDFREQUENCYOFCLINICALCHARACTERISTICSINSLE临床表现ANA关节炎光敏感SM抗体抗DSDNA抗体血液学异常蝶形红斑口腔溃疡浆膜炎肾炎神经系统紊乱盘状红斑SLE1348978716275254496367595410177387062414308966904980620415SLE4835253864446900646374637927526389827013079470651131694119285表5分层分析系统性红斑狼疮易感性和BLKRS2248932位点的关联性TABLE5ASSOCIATIONOFBLKRS2248932WITHSLEANALYZEDBYSUBPHENOTYPESTRATIFICATION临床表现神经系统紊乱关节炎光敏感抗SM抗体抗DSDNA抗体血液