他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证：对il-23,th17轴的影响

他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23,TH17轴的影响暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响硕士研究生张顺莲导师邓列华教授摘要【目的】通过检测他克莫司软膏对寻常型银屑病患者治疗前、后外周血TH17细胞及其相关细胞因子IL23的变化,探讨他克莫司对银屑病IL23/TH17轴的抑制作用和作用靶点,了解他克莫司对IL23/TH17轴的抑制强度,为他克莫司软膏治疗银屑病提供可行性理论依据。【方法】按照入选标准,随机选择确诊寻常型银屑病患者32例,给予01他克莫司软膏PROTOPIC,普特比外用,2次/D,持续用药8周。治疗前和治疗后,抽取患者外周血,分别提取单个核细胞PBMC供流式细胞学技术检测外周血TH17细胞的含量及应用酶联免疫吸附试验ELISA检测血清IL23的表达水平,并以32例正常对照组作为分析比较。【结果】寻常型银屑病患者治疗前的PBMCTH17细胞表达率为553089055,明显高于健康对照组的318866765治疗前寻常型银屑病患者血清IL23的表达水平为27868740835PG/ML,明显高于健康对照组的12742530258PG/ML,差异均有统计学意义P005。他克莫司软膏治疗后寻常型银屑病患者PBMC的TH17细胞表达水平为404477317,明显低于治疗前的553089055他克莫司软膏治疗后寻常型银屑病患者血清IL23表达水平G/ML,明显低于治疗前的27868740835PG/ML,差异均有统计学意义P005。【结论】通过研究结果表明,寻常型银屑病患者PBMC的TH17细胞和血清中IL23表达水平明显高于健康对照组。他克莫司软膏治疗后可明显降低寻常型银屑病患者PBMC的TH17细胞和相关细胞因子IL23表达水平,显示他克莫司对寻常型银屑病炎症细胞及相关细胞因子具有一定调节作用。【关键词】他克莫司软膏寻常型银屑病TH17细胞白细胞介素23I暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响THEPIVOTALVALIDATIONOFTACROLIMUSOINTMENTTREATMENTINPSORIASISTOIL23/TH17AXISINFLUENCEMASTERCANDIDATECHONGSOONLAINSUPERVISORPROFESSORDENGLIEHUAABSTRACTOBJECTIVEDETERMINATIONTHEEFFECTSOFTACROLIMUSOINTMENTONEXPRESSIONOFTH17ANDITRELATEDCYTOKINEIL23INTHESERUMOFPATIENTSWITHPSORIASISVULGARIS,TOANALYZEITSTHERAPEUTICMECHANISMSTOTHEINTERLEUKINIL23/THELPERTH17CELLAXISMETHODACCORDINGTOTHEINCLUSIONCRITERIA,ATOTALOF32PATIENTSWITHPSORIASISVULGARISWERETREATEDWITHTWICEDAILYAPPLICATIONSOF01TACROLIMUSOINTMENTPROTOPICTOTHEPSORIATICLESIONSAREASFOR8WEEKSSERIALBLOODSAMPLESWERECOLLECTEDBEFOREANDAFTERTACROLIMUSOINTMENTTREATMENT,THEEXPRESSIONOFTH17ANDIL23WEREMEASUREDANDEVALUATEDBYFLOWCYTOMETRYANDENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYELISAINPATIENTS,AND32NORMALCONTROLSFORCOMPARISONRESULTSCOMPAREDWITHCONTROLGROUP,PATIENTSWITHPSORIASISVULGARISHADELEVATEDLEVELSOFTH17ANDIL23P005AFTERTHETREATMENT,THELEVELSOFTH17ANDIL23WERESIGNIFICANTLYDECREASEDP005CONCLUSIONTHERESULTSOFTHISSTUDYINDICATETHATTACROLIMUSMAYREGULATETH17ANDTH17CELLRELATEDCYTOKINESIL23TOPLAYAROLEINTREATINGPSORIASISVULGARIS,ANDITISIMPORTANCETOREGULATINGTHEIL23/IL17IMMUNEAXISANDEMPHASIZESSOMEROLEOFIL23INTHEDEVELOPMENTANDMAINTENANCEOFCHRONICINFLAMMATORYAUTOIMMUNEDISEASESSUCHASPSORIASISKEYWORDSTACROLIMUSOINTMENTPSORIASISVULGARISTHELPERTH17CELLINTERLEUKINIL23II暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响目录中文摘要ABSTRACT目录1前言111研究背景12临床资料与方法921研究对象及药物9212药物9213方法9214其它观察指标922实验方法9221寻常型银屑病患者及健康对照组外周血THL7细胞水平的检测9222寻常性银屑病患者及健康对照组外周血IL23水平的检测1223统计学方法1424结果1525讨论22251流式细胞术检测寻常型银屑病患者PBMCTH17细胞表达水平23252ELISA法检测寻常型银屑病患者血清IL23表达水平24253寻常型银屑病患者外周血TH17与IL23表达水平的PEARSON相关性分析25254外周血TH17和IL23水平诊断银屑病的ROC曲线分析26255他克莫司软膏治疗后寻常型银屑病患者的不良反应与观察指标变化26256本研究需改善之处263结论28参考文献29附录文献综述33III暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响综述参考文献37英文缩略词对照表40在读硕士学位期间参加科研项目、发表学术论文及参加学术会议情况41致谢42IV暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响硕士研究生张顺莲导师邓列华教授1前言11研究背景1银屑病PSORIASIS是一种常见的慢性、复发性、炎症性皮肤病。据调查,银屑病的发病率占世界人口的013,黄种人发病率为0103。我国于1984年曾进行一次全国银屑病流行病学调查,结果显示银屑病平均患病率为016。2010年中国六省市银屑病流行病学调查发现,我国银屑病患病率为047,发病高峰年龄为2029岁及40249岁,其中6765在40岁前发病,临床分型中以寻常型为主9706。根据文献报导,国内银屑病发病率有增高的趋势,银屑病病程长且治愈后易于复发,故对患者的身心造成巨大影响。因此,银屑病是当前皮肤科领域内重点研究的疾病之一。银屑病的病因及发病机理至今仍未完全明确。本病发生与发展的主要原因或诱因有遗传、免疫、感染、内分泌、神经精神、药物、环境因素及生活习惯等。银屑病主要的组织病理改变为角质形成细胞的异常增殖、角化不全、新生血管形成以及真皮内大量炎性细胞的浸润。近年来国内外许多相关研究多认为银屑病是一种以T细胞为主,多基因遗传缺陷多因素作用所共同参与的慢性炎症性皮肤病。既往银屑病被认为是一种以TH1为主的疾病,但新近有关银屑病免疫病理机制的研究发现,银屑病的发病与CD4T细胞新亚3群TH17细胞关系密切。目前研究显示IL23/TH17细胞通路是银屑病发病机制中的重要环节之一,但有关TH17细胞在银屑病发病中的作用机制仍未明确。在不同的转录因子和细胞因子的作用下,初始CD4T细胞分化为辅助性T细胞TH细胞和调节性T细胞TREG细胞,其中TH细胞又可分为以产生IFN、IL2活性因子的TH1细胞及以分泌IL4与IL5等细胞因子为主TH2细胞,在机体免疫防御机制中分别参与细胞免疫和体液免疫应答。近年来研究发现,机体存在一种有别于TH1和TH2细胞的CD4T细胞新亚群,即辅助性T细胞17TH17。TH17细胞在诱导条件、分化与发育途径及所产生的细胞因子均与THL/TH2型辅助细胞存在极大的差异。TH17细胞可分泌IL17A、IL17F、IL1、IL6、IL21、IL22、GMCSF及IFN等活性因子,其中IL17A是TH17细胞高表达的细胞因子,与IL17R结合后主要的生物学效应是诱导组织炎症细胞的活化和聚集,介导和促进炎性反应。研究显示,IL17A与受体结合后,能促进机体产生趋化1暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响因子,进而促使单核细胞、中性粒细胞等的动员。此外,尚可诱导角质形成细胞等的增生分泌IL6、IL8及IL23等活性因子,增强局部的炎症反应。这些炎症细胞、细胞因子4及趋化因子等在多种慢性炎症、自身免疫性疾病的发生发展中起着一定的作用。在正常的免疫系统内稳态的条件下,T细胞介导免疫反应在精细平衡系统下运行图11。T细胞的激活需要双信号刺激作用,第一信号即T细胞受体与抗原提呈细胞APC的抗原肽MHC分子复合物的结合。T细胞活化的第二信号来自协同刺激分子,即APC上的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体结合。若T细胞识别抗原时没有协同刺激分子作为第二信号,则T细胞不能充分活化,不能表现效应功能。激活的T细胞可分泌IFN等进一步促进角质形成细胞KC产生ICAM1及多种炎症因子的分泌,特别是IL1、IL6、IL8和IFN,放大免疫级联反应。然而,有关银屑病的免疫遗传学研究显示,银屑病患者高表达TH17细胞并大量释放IL17等相关细胞因子刺激和调节内皮细胞和角质形成细胞使其异常增殖与分化,同时可趋化中性粒细胞使其在皮损真皮血管周围聚集浸润形成5,6微脓肿而形成银屑病特殊的组织病理改变。在银屑病免疫病理过程中多种异常增生的炎性细胞及其所产生的活性因子的刺激作用,进而形成持久的慢性炎症性损害。6图11CD4T细胞亚型在银屑病的作用。在正常的免疫内稳态的条件下,T细胞介导免疫反应在精细平衡系统下进行。在银屑病中,这种平衡被破坏,由TH17、TH1细胞所产生的促炎细胞因子则主导一系列免疫刺激反应的发生。2暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响初始CD4T细胞分化为能产生IL17A的TH17细胞要接受多种重要因子的诱导和维持。原始CD4T细胞在TGF及IL6的协同调节下,诱导CD4T细胞充分表达孤核受体RORT,促进编码IL17A等的基因转录,而使CD4T细胞向TH17细胞方向分化与发育7。此外,IL23是TH17细胞分化过程后期中重要作用因子之一。IL23主要由角质形成细胞和活化的树突状细胞及其他抗原递呈细胞所分泌产生,它是由P40亚基和无活性的P19亚基通过二硫键相结合组成的异二聚体,其受体IL23R特异表达于TH17细胞表面,而8不表达在其他TH1/TH2辅助型细胞或调节性TTREG细胞上。IL23主要作用于TH17细胞,刺激TH17细胞的扩增及维持其表达。研究指出,IL23是TH17细胞分化过程后期中维持TH17细胞分化和成熟的重要调节因子,并可诱导分泌L17A、IL17F、IL22、IL26、9,10IFN及RORT等多种细胞因子。另有研究指出,IL23可与TGF联合诱导RORT促进IL17及促炎性因子表达。此外,还可诱导THL7细胞表达1L23R,而IL23R的表达能够迅速促使HL7细胞对角质形成细胞及树突细胞等细胞所分泌的IL23产生反应,从而刺激11TH17细胞的扩增和维持,发挥上调TH17细胞的效应细胞功能和致病性。既往的研究已证实IL23是多种自身免疫性疾病的关键性启动因子。近年来研究发现12IL23与银屑病的致病性有关。有关IL23/TH17轴在银屑病发病中的作用,相关的研究表明银屑病患者皮肤损害区角质形成细胞与真皮内高度表达IL17MRNA及IL23细胞因13子,且其表达水平显著高于银屑病患者非皮损区及健康者皮肤。据文献报道,银屑病的发生发展与IL17基因过度表达有所关联,并且认为银屑病皮损中IL23高度表达可能促使IL17的分泌增加,从而形成了IL23/IL17轴作用途径,导致银屑病角质形成细胞的增14值和皮肤炎症的持续进展。有学者在基因水平上研究发现,健康人及银屑病患者IL23R15和IL12/23P40的基因与银屑病的发生发展有密切相关。另有研究报道也指出银屑病患者存在IL23R与IL12B的基因变异,这些基因变异对于IL23在银屑病的发病机制中的效16应可能有着重要影响。在临床上针对人抗IL12亚单位P40和IL23单克隆抗体在银屑病17的治疗上已取得一定的疗效。此外,最新的关于对银屑病遗传风险的研究也证实IL23A/B亚基和R受体遗传位点的突变与银屑病的发病相关,基因变异参与的IL23信号18传递在银屑病的发病机制中有重要作用。近年来国内外的研究不仅证实了银屑病是以TH17为主TH1为辅的T细胞免疫性皮19肤病,而且指明了银屑病的治疗新方向是研发针对IL23/TH17轴更有选择性的靶向治疗药物来作为治疗银屑病的有效方法。3暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响银屑病为一种慢性疾病,在治疗上通常采取长期治疗的手段,并按轻、中、重三度给予不同的治疗方案。轻度,特别是寻常型银屑病轻微者,只需要外用药物治疗,且应选用不良反应最小的药物治疗和疗法。中、重度银屑病的治疗往往需要采用联合疗法。目前常作为系统用药与疗法的有维A酸类药物如阿维A、甲氨喋呤、环孢素、羟基脲、柳氮磺砒啶、补骨脂素长波紫外线PUVA、中波紫外线UVB、中草药及生物制剂等。局部外用药物有维生素D3衍生物如卡泊三醇、他扎罗汀、蒽林地蒽酚、20,21焦油和糖皮质激素等。目前最具有潜力治疗银屑病的方法是生物疗法,此类药物有阿达木单抗ADALLIMUMAB、依法利珠单抗EFALIZUMAB、依那西普单抗ETANERCEPT、英夫利昔单抗INFLIXIMAB及阿法西普单抗ALEFACEPT。生物疗法可作为治疗银屑病关节炎及一些中、重度银屑病患者的一项相当有利的选择。虽然这些药物和治疗方法在银屑病治疗上都取得一定的疗效,但在需长期治疗的银屑病患者而言,安全性、疗效及便捷性的影响因素仍限制了这些药物与疗法的应用进展。外用糖皮质激素是目前治疗银屑病最广泛的药物,为轻,中度的银屑病患者的一线治疗药物。它具有使真皮血管收缩、抗细胞有丝分裂、抑制细胞因子、抗炎症、免疫抑制及抗表皮增生等功能,其作用迅速且疗效显著。外用糖皮质激素类药物长期应用可能会造成局部皮肤发生萎缩、色素沉着、毛细血管增生扩张、变应性接触性皮炎、口周皮炎以及继发细菌、病毒和真菌感染等不良反应。临床治疗时经常会出现停药后皮损加重或产生反跳现象。若长期全身大面积广泛外用糖皮质激素,还有可能引起肾上腺皮质萎22缩以及全身系统性的不良反应。由于银屑病系统治疗不良反应明显,外用糖皮质激素类药物易造成依赖性及反复性。因此,选择疗效好,副作用小的药物在银屑病的治疗中更显重要。在这种情况下,可以23局部应用免疫抑制剂如钙调磷酸酶抑制剂CALCINEURININHIBITOR,CNI。他克莫司TACROLIMUS及吡美莫司PIMECROLIMUS为子囊霉素ASCOMYCIN衍生物。是一类目前被广泛应用并可替代糖皮质激素的钙调磷酸酶抑制剂,其作用的主要靶点为T细胞。相关研究指出,外用他克莫司、吡美莫司钙调磷酸酶抑制剂对治疗特异性皮炎或自身免疫性疾病如银屑病等疗效好,安全性高,长期应用并不会产生类似外用糖皮质激素的不良反应,或是系统性免疫抑制的副作用。因此,认为这类钙调磷酸酶抑制剂适宜需间歇性长24期应用的患者,以有效控制相关疾病的复发。他克莫司TACROLIMUS,FK506是日本藤泽制药公司于1984年由链霉菌STREPTOMYCES4暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响TSUKUBAENS培养液中发现提取的一种强效大环内酯类免疫抑制剂,分子量为822道尔顿,25,26分子式为CHNO图12。他克莫司主要作用于淋巴系统,是T细胞活化的免446912疫抑制剂。研究报道表明他克莫司的免疫抑制作用与目前临床广泛应用的环孢素相似,尽管它在结构上与环孢素无关联,但两者的作用目标皆为T细胞,且其抑制免疫反应的作用较环孢素强大其体外免疫抑制活性是50100倍,体内为1020倍,毒副作用明显低27,28于环孢素图13。他克莫司通过选择性抑制T细胞活化及克隆增殖过程中基因的表达来抑制细胞增殖的信号传导通路而发挥作用,但其并不影响T细胞的活化过程早期的抗原识别和产生活化信号阶段。主要途径是他克莫司通过与特异性胞浆内免疫亲和蛋白IMMUNOPHILINSFKBP12结合形成复合物后,阻断细胞内磷脂酶钙调神经磷酸酶CALCINEURIN的活性,抑制T细胞内钙依赖性信号传导途径,从而抑制白介素IL2、IL3、IL4、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GMCSF、肿瘤坏死因子TNF及干扰素IFN29等T细胞活化因子的基因转录。体外实验研究发现,他克莫司除可抑制皮肤中的嗜碱性粒细胞及肥大细胞胞内炎性介质的释放,还可有效降低皮肤朗格罕斯细胞诱导T淋巴细30胞的活化及增殖。26图12他克莫司化学分子结构5暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响28图13他克莫司的免疫抑制机制与环孢素相似,但其抑制免疫反应的作用较环孢素强他克莫司于1994年通过美国食品和药物管理局FDA批准作为肝肾等移植术后用于预防及治疗移植物排斥反应的免疫抑制药物,可特异性抑制细胞毒T细胞来发挥作用。此外,他克莫司分子质量小,对皮肤渗透性好,目前在皮肤科的应用越来越广泛。国内外31,32有许多临床研究已证实他克莫司除应用于特应性皮炎具有显著疗效外,尚可用于银33,34屑病等其他自身免疫性疾病。在银屑病的治疗中,由于他克莫司特异的抗炎作用,35相较于糖皮质激素更适用于面部和褶皱部位银屑病的治疗,且疗效显著。他克莫司软膏TACROLIMUSOINTMENT,商品名普特彼PROTOPIC,安斯泰来ASTELLAS制药有限公司,外用制剂为003和01白色至淡黄色软膏。于2002年上市并已获美国FDA批准作为二线药物治疗湿疹及特应性皮炎,其中003他克莫司软膏及外用吡美莫司36已被批准用2岁以上幼儿。2005年4月我国批准此药进口上市进口药品注册证H20040735H20040736。当前,普特比尚未获得FDA批准用于银屑病的治疗。但在临床治疗上,他克莫司对成人及儿童全身体表,包括头面部颈部和皱褶部位的银屑病皮损37皆具有显著疗效。在外用他克莫司的药物安全性及不良反应方面,由于缺乏长期安全研究数据和恶性6暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响肿瘤发展潜在风险的研究评估,但一些动物研究报告指出钙调磷酸酶抑制剂和紫外线的使用可能导致上皮肿瘤风险的增加。2005年,FDA对他克莫司软膏及吡美莫司乳膏提出了“黑框警告”。然而,迄今临床上仍无相关证据显示应用这两种局部钙调磷酸酶抑制剂与增加癌症风险之间有任何因果关系。最新的研究数据表明,外用他克莫司并不会增加紫38外光诱导小鼠皮肤的致癌风险。在临床治疗上,针对同时接受紫外线治疗的银屑病患36者仍应谨慎使用局部钙调磷酸酶抑制剂。他克莫司可归类为一种强效的抗炎药物,外用制剂主要具有局部免疫抑制调节及抗炎作用,且局部外用对系统吸收极少,长期应用亦不会造成系统性不良反应或增加继发感染的机会。此外,此类药物主要作用于辅助型T39细胞,而不影响抑制型T细胞的活化和B细胞产生抗体的能力。他克莫司的药物不良反40应较少,系统用药主要的副作用为肾毒性,也可见神经毒性、胃肠道反应等。外用可能会引起如皮肤烧灼感、瘙痒/瘙痒加重或刺痛等局部刺激反应。这些不良反应最常见于最初用药的几天内一般不需特殊处理,症状可于数天后消退。据有关系统评价外用他克莫司软膏治疗特应性皮炎安全性的临床研究资料显示,外用他克莫司后约8124的患41者血药浓度低于最低可测浓度05NG/ML,持续时间非常短暂且无药物蓄积现象。综合而言,外用他克莫司在治疗银屑病上具有良好疗效和安全性。12研究目的与临床意义银屑病是一种常见的免疫异常性增殖性皮肤病,其发病机制与近年新发现的CD4T细胞亚群TH17细胞关系密切。近年来的研究表明IL23/TH17细胞通路是银屑病发病机制中的重要环节之一,但TH17细胞在银屑病发病中的作用机制仍不明确。许多临床和实验研究也证实他克莫司在治疗SLE、类风湿性关节炎及银屑病等自身免疫性疾病具有较显著的疗效。本研究拟检测寻常型银屑病外周血单核细胞表达TH17细胞及其相关细胞因子IL23的水平,并观察外用他克莫司软膏治疗后,对患者PBMCTH17细胞及IL23细胞因子的影响。探讨他克莫司软膏对寻常型银屑病IL23/TH17轴的抑制作用和作用靶点,了解他克莫司软膏对IL23/TH17轴的抑制强度,为他克莫司软膏治疗寻常型银屑病提供可行性理论依据。具体的研究内容为1、检测比较寻常型银屑病患者与健康对照组PBMC中TH17细胞及血清IL23细胞因子的表达水平。2、分析外用他克莫司软膏治疗前、后寻常型银屑病患者PBMC中TH17细胞及血清IL23细胞因子表达水平的影响。7暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响3、探讨他克莫司软膏对寻常型银屑病发病关键环节IL23/TH17轴是否具有调节作用及作用程度,并进一步探讨他克莫司软膏治疗寻常型银屑病的作用机理。8暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响2临床资料与方法21研究对象及药物选择2010年3月2012年9月确诊寻常型银屑病患者32例。纳入标准符合寻常型银屑1病诊断及分度标准,银屑病面积和严重程度指数PASI评分120的轻、中度患者。排除标准中具有下列情况之一者不列入研究范围严重心、肺、肝、肾等重要脏器及血液、内分泌系统病变妊娠及哺乳期妇女慢性感染病史近期感染大环内酯类抗生素过敏史或其他药物过敏及过敏体质者合并其他严重需治疗的皮肤病应用他克莫司之前1个月使用细胞毒免疫抑制剂和伴有风湿性疾病者。治疗组共32例,其中女性18例,男性14例,年龄1852岁,平均年龄3134岁健康对照组共32例,其中女性17例,男15例,年龄1848岁,平均年龄3194。两组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义P005,具有可比性。212药物01他克莫司软膏TACROLIMUSOINTMENT,商品名普特彼PROTOPIC,安斯泰来ASTELLAS制药中国有限公司,进口药品注册证H20040736,国药准字J20100015213方法给予32例寻常型银屑病患者01他克莫司软膏普特彼治疗,每日2次外用,持续用药8周。按银屑病外用药物治疗与管理指南ALANMENTER,ETAL,2009,以FTUFINGERTIPUNIT成人指节单位作为评估及控管使用剂量,指导患者正确使用外用制剂的方法与用量。32例健康对照组不采用任何药物。所有患者在治疗前和治疗后抽取外周静脉血进行检测。214其它观察指标在治疗开始、治疗4周及治疗8周后检查寻常型银屑病患者血、尿常规、肝肾功能等,如有异常则停止用药。详细记录治疗过程中出现的不良反应。22实验方法221寻常型银屑病患者及健康对照组外周血THL7细胞水平的检测2211外周血的采集和保存采集入选受试者清晨空腹外周静脉血各4ML,置于肝素钠真空采血管中,倒转摇匀,使肝素钠和血液混匀,常温保存,于2小时内提取外周血单个核细胞PBMC供流式细胞学检测。2212主要试剂9暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响试剂名称产品厂商鼠抗人CD4FITC美国BD公司鼠抗人IL17PE美国BD公司鼠抗人IGG2AFITC美国BD公司鼠抗人IGG1PE美国BD公司PH7274磷酸盐缓冲液PBS博士德公司淋巴细胞分离液上海国药集团化学试剂有限公司洗涤液PERM/WASHSOLUTIONPHARMINGEN产品美国BD公司用前10X稀释细胞培养基中国医学科学院基础医学细胞中心胎牛血清中国医学科学院基础医学细胞中心HEPES溶液中国医学科学院基础医学细胞中心佛波酯聚丙烯酸甲酯PMA美国INVITROGEN公司溶血素用前10X稀释使用美国BD公司阻断剂GOLGIPLUG美国BD公司破膜剂CYTOFIXPERMSOLUTION美国BD公司固定剂1PFA多聚甲醛北京化学试剂公司2213主要实验器材实验器材器材厂商肝素钠抗凝真空采血管奥地利GREINERBINONEGMBH公司24孔板奥地利GREINERBINONEGMBH公司微量离心管美国AXYGEN公司离心机德国EPPENDORF公司微量加样器法国GILSON公司JTT7A超净工作台北京半导体设备公司涡旋振荡器江苏海门仪器厂80超低温冰箱日本SANYO公司YJ875型医用净化工作台苏州净化设备公司流式细胞仪型号FACSCALIBUR美国BD公司10暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响流式专用试管美国BD公司恒温箱浙江余姚工业仪表二厂培养板、TIP头等一次性耗材美国COMING公司2214FICOLL密度梯度离心法分离外周血单个核细胞PBMC将肝素钠抗凝静脉全血4ML置于离心管中1500RPM/室温离心6MIN,血浆吸出后分装于冻存管中,以备细胞因子检测。血细胞加入3倍体积的磷酸盐缓冲液PBS,混匀。淋巴细胞分离液置于离心管中,将稀释后之抗凝血贴壁加入离心管,使平铺于淋巴分离液上淋巴细胞分离液与稀释后血细胞的体积比为11。2000RPM/室温不刹车离心20MIN,吸取云雾层,即为所需PBMC细胞。云雾层用等量PBS洗涤,1500RPM/4离心8MIN,弃上清液再加2MLRPMI1640洗涤一次,1500RPM/4离心8MIN,弃上清液。用PBS定容至1ML,取10UL490ULPBS混匀,用细胞计数板计数细胞数,细胞总数4四角方格内细胞数之和/45010/ML。2215PBMC刺激培养6用RPMI1640稀释至PBMC终浓度2510细胞/ML。取PBMC稀释液1ML于24孔板中,加入10NG/ULPMA3UL终浓度为30NG/ML,100NG/ULLONO75UL终浓度为750NG/ML及GOLGIPLUG1L含BREFELDINA在37孵育5小时。2216流式细胞表面染色将刺激培养后之PBMC转移至离心管,用2ML1PBS洗涤,1500RPM/4离心8MIN,弃上清液重复操作L次。取4个流式管,分别标记BLANK,FITC,PE,FITCPE。用LFBS/PBS将沉淀稀释至1000UL,每个流式管分别加入100UL细胞悬液,使每管细5胞数为11010。细胞表面染色在BLANKIGG2A、FITC、FITCPE管中,分别加入10ULCD4FITC,充分摇匀,4孵育30MIN。2217固定破膜上述每管加入2ML1FBS/PBS洗涤,1500RPM/4离心8MIN,弃上清液重复操作一次。11暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响每管加入500UL预冷4固定液。室温孵育10分钟后1000RPM离心10分钟,弃上清液,加入适量PBS洗涤一遍,1000RPM离心10分钟后弃上清液。破膜打孔每管加入250UL破膜液,充分混匀,4孵育30MIN。取PER/WASH10BUFFER,加入9倍体积的蒸馏水,得到PER/WASHLBUFFER。用PER/WASH1BUFFER洗涤,1300RPM/4离心8MIN,弃上清液重复一次。2218流式细胞内染色细胞内染色BLANKIGG1、PE、FITCPE管,分别加入20ULIL17PE,充分混匀,4孵育45MIN。每管加入1MLPER/WASH1BUFFER洗涤,1300RPM/4离心8MIN,弃上清液,重复操作1次。每管加入500ML1PFA固定,于2448小时之内上机检查。2219流式细胞仪检测上机前每管加入2MLPBS,于1300RPM/48MIN洗涤2次,沉淀用PBS稀释至300500ML。用空白管设置电压条件,用FITC和PE管设置补偿条件。按上述条件,于流式细胞仪上对PEFITC管进行检测,每管共计数20000个细胞,测定PEFITC细胞的分布及PE平均荧光强度。222寻常性银屑病患者及健康对照组外周血IL23水平的检测2221外周血的采集和保存采集入选受试者清晨空腹外周静脉血各2ML,采用EDTA抗凝,标本采集后30分钟内采用1000G离心15分钟,分离获得血浆。标本收集后置于80冰箱冻存待测,但应注意避免反复冻融。2222主要试剂试剂名称产品厂商EDTA抗凝剂美国SIGMA公司人IL23ELISA试剂盒美国EBIOSCIENCE公司2223主要实验器材实验器材器材厂商YJ875型医用净化工作台苏州净化设备公司12暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响可调式微量移液器法国GILSON公司MH1型微量振荡器江苏海门医用仪器公司80超低温冰箱日本SANYO公司2MCOISOCO培养箱日本SANYO公司ASCENT酶标仪芬兰LABSYSPEMS公司96孔板美国BECKMANCOULTER公司2224方法酶联免疫吸附试验ENZYMELINKEDIMMUNESORBENTASSAY,ELISA人IL23ELISA试剂盒内容4保存产品名称规格标准品2/1支冻干标本及标准品稀释液1瓶酶结合物稀释液1瓶浓缩酶结合物避光2/1支浓缩洗涤液1瓶浓缩生物素化抗体2/1支显色剂AL瓶显色剂B避光L瓶终止液1瓶抗体包被板条812或86封板胶纸1份具体操作方法试剂准备人IL23ELISA试剂盒提早20MIN由冰箱中取出备用,待试剂平衡至室温。取浓缩洗涤液60ML以蒸馏水稀释至600ML备用,剩余的浓缩洗涤液4保存在冰箱。配制工作液以1250按实际用量以将酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物,混匀后再以此液按1250稀释浓缩生物素化抗体。配制标准品取10ML标准品/样品稀释液将冻干标准品复溶,静置15分钟后混匀,然后等比稀释8个浓度梯度。加样温育按顺序将样品对应反应孔编号。除空白孔外,分别将标本或不同浓度标准品每孔100UL加入相应孔中,用封板胶纸封住反应微孔,37孵育120分钟。13暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响洗板取出所需已达室温的抗体包被板条。弃去反应板孔内液体,甩干,用洗涤液将反应板充分洗涤4次,每次浸泡1分钟,在滤纸上印干。每孔加入100UL检测工作液空白孔除外,封住板孔,置室温孵育60分钟。重复操作洗板4次。显色每孔各加入50UL底物A、B,置室温避光25分钟。加入终止液50UL/孔,混匀。比色即刻在450NM波长处测各孔的OD值。结果判读ELISA定量测定判读逐一将标准品和标本的OD值减去空白孔的OD值。以标准品浓度做横坐标,以吸光度为纵坐标,将各浓度的值逐点以平滑线连接,绘制标准曲线,通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。23统计学方法正态分布计量资料数据采用均数标准差XS表示,统计数据保留至小数点后三位。应用SPSS130统计软件软件SPSS,INC,CHICAGO,IL进行统计学分析。统计学方法包括对各组数据进行正态性检验及方差齐性检验独立样本T检验、配对样本T检验和PEARSON双变量相关分析,求相关系数R及显著性检验。P005认为差异有统计学意义。14暨南大学硕士学位论文他克莫司软膏治疗银屑病的关键性验证对IL23/TH17轴的影响24结果241外周血TH17流式细胞仪技术检测分析1治疗前、后寻常型银屑病组与健康对照组PBMCTH17细胞表达率的比较经两样本T检验,治疗前、后寻常型银屑病组与健康对照组PBMCTH17细胞表达率分别为553089055、404477317和318866765。其中治疗前寻常型银屑病组PBMCTH17细胞表达率明显高于健康对照组,差异有统计学意义T11723,P005。治疗后寻常型银屑病组PBMCTH17细胞表达率较高于健康对照组,差异有统计学意义T4860,P005,见表21,图21。表21寻常型银屑病组与健康对照组外周血TH17细胞表达水平的比较组别例数TH17T值P值健康对照组32例318866765553089055117230000治疗前寻常型银屑病组32例治疗后寻常型银屑病组32例40447731748600000与健康对照组相比,80007000776