ae1在胃和结肠腺癌组织中的表达及致癌作用的研究（可编辑）

AE1在胃和结肠腺癌组织中的表达及致癌作用的研究上海交通大学硕士学位论文AE1在胃和结肠腺癌组织中的表达及其致癌作用的研究姓名沈炜炜申请学位级别硕士专业病理学与病理生理学指导教师傅国辉20080501全文缩略语中英文对照全文缩略语中英文对照缩略语英文中文AE1ANIONEXCHANGER1阴离子交换蛋白1KAE1KIDNEYANIONEXCHANGER1肾脏阴离子交换蛋白1EAE1ERYTHROCYTEAE1红细胞阴离子交换蛋白1PTKPROTEINTYROSINEKINASES蛋白酪氨酸激酶CAIICARBONICANHYDRASEII碳酸酐酶IISAOSOUTHEASTASIANOVALOCYTOSIS东南亚卵形红细胞症DRTADISTALRENALTUBULARACIDOSIS远端肾小管酸中毒MIRNAMICRORNA小分子RNAPCRPOLYMERASECHAINREACTION聚合酶链反应RTPCRREVERSEDTRANSCRIPTIONPCR逆转录PCR免疫共沉淀COIPCOIMMUNOPRECIPITATIONFITCFLUORESCEINISOTHIOCYANATE异硫氰酸荧光素DNTPDEOXYNUCLDEOSIDETRIPHOSPHATE脱氧三磷酸核甘酸BSABOVINESERUMALBUMIN牛血清白蛋白HRPHORSERADISHPEROXIDASE辣根过氧化酶RTREVERSETRANSCRIPTION反转录SDSSODIUMDODECYLSULFATE十二烷基硫酸钠SIRNASMALLINTERFERINGRNA小分子干扰RNAPAGEPOLYACRYLAMIDEGELELECTROPHORESIS聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPHOSPHATEBUFFEREDSALINE磷酸盐缓冲液TRISTRISHYDROXYMETHYLAMINOMETHANE三羟甲基氨基甲烷ECOLIESCHERICHIACOLI大肠埃希菌5上海交通大学硕士学位论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名日期年月日上海交通大学硕士学位论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密,在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。请在以上方框内打“”学位论文作者签名指导教师签名日期年月日日期年月日中文摘要AE1在胃和结肠腺癌组织中的表达及其致癌作用的研究中文摘要阴离子交换蛋白1ANIONEXCHANGER,AE1又名带3蛋白,是存在于红细胞膜上的主要内在性糖蛋白质,介导CL和HCO跨膜交换过程,调节细胞内的3PH值。我们在对AE1C端域结构与功能进行研究的过程中发现并报道了AE1与关键的肿瘤抑制蛋白P16直接相互作用。这是国内外关于膜蛋白质与P16结构与功能相关的首次报道。P16通过与CDK4/CDK6直接相互作用负调节细胞周期。由于在大量的临床肿瘤病例中发现了高频率的P16缺失和突变,使之与P53一样成为众多肿瘤相关蛋白中重要的研究目标。十余年来基础和临床研究发现P16除调节细胞周期外,还有其他多重生物学功能,但是,这些研究主要将目光集中在P16调节的对象而忽略了或没有突破P16本身受哪些因素的调控。P16与AE1相互作用的发现,为AE1及P16功能的调控提供了新的研究线索。为深入研究AE1和P16相关的生理和病理学意义,我们对6种肿瘤细胞系AE1、AE2和P16的表达进行了检测,WESTERNBLOTTING结果显示所有肿瘤细胞都与正常组织一样表达AE家族成员AE2,但AE1异常表达在胃腺癌和结肠腺癌细胞正常组织不表达AE1,采用免疫细胞化学及膜浆分离的方法对两种肿瘤细胞AE1和AE2进行定位发现AE2主要定位于细胞膜,而AE1主要分布在细胞浆。通过核浆分离对P16在细胞内的表达进行检测,结果显示该蛋白也异常分布在胃腺癌和结肠腺癌细胞浆,这一结果提示P16的胞浆分布可能与AE1的异常表达相关,COIP证明了内源性AE1和P16在两种肿瘤细胞内相互作用。由于AE1和AE2是调节细胞PH值的重要蛋白质,AE1的异常表达可能影响细胞PH的正常调节,因此,我们采用离子成像分析系统对单个肿瘤细胞的PH进行检测,结果发现胃腺癌和结肠腺癌比其他肿瘤细胞偏碱性。为排除P16在细胞浆内的分布源于细胞内PH的改变的可能性,本研究将胃腺癌和结肠腺癌细胞培养在酸性环境PH60中1272小时,结果证明胃腺癌细胞P16的表达水平在酸性环境培养下3648小1中文摘要时升高、72小时下降。结肠腺癌细胞P16的表达水平不变化。P16在两种肿瘤细胞浆内的定位未受酸性PH的影响。上述结果说明P16在两种肿瘤细胞浆内分布是通过与AE1直接相互作用而被扣押。在胃腺癌和结肠腺癌细胞过表达AE1扣押了更多的P16,而采用RNAI技术将AE1KNOCKDOWN,使P16释放并重新定位于细胞核。稳定KNOCKDOWNAE1的肿瘤单克隆细胞出现生长抑制和死亡。通过本研究我们提出肿瘤发生相关的P16功能失调的新机制。本研究进一步对临床胃腺癌和结肠腺癌的术后组织进行了免疫组织化学和WESTERNBLOTTING分析,所检测的8333胃腺癌和5652结肠腺癌组织中有AE1异常表达并伴随P16的异常。关键词阴离子交换蛋白1P16胃腺癌结肠腺癌小分子RNA2英文摘要EXPRESSIONOFAE1INGASTRICANDCOLONICADENOCARCINOMAANDITSROLEINCARCINOGENESISABSTRACTANIONEXCHANGER1AE1ISATRANSMEMBRANEPROTEINTHATFACILITATETHEELECTRONEUTRALEXCHANGEOFCLANDHCOACROSSTHEPLASMAMEMBRANEANDEXPRESSED3ABUNDANTLYINERYTHROCYTESOURFINDINGPRESENTEDHEREFORTHEFIRSTTIMETHATTHEDIRECTINTERACTIONOFAE1ANDP16INGASTRICANDCOLONICADENOCARCINOMACELLSP16BINDSTOCYCLINDEPENDENTKINASE4/6CDK4/6ANDNEGATIVELYREGULATESCELLGROWTHSEVERALFACTORSAREINVOLVEDINTHEMECHANISMSOFFUNCTIONALINACTIVATIONOFP16INHUMANMALIGNANCIESSUCHASHOMOZYGOUSDELETIONS,INTRAGENICMUTATIONS,ANDTRANSCRIPTIONALSILENCINGDUETOPROMOTERHYPERMETHYLATIONAPARTFROMCELLCYCLECONTROL,EXTENSIVESTUDIESHAVELEDTOUNDERSTANDINGOFTHEADDITIONALBIOLOGICALFUNCTIONSFORP16HOWEVER,THEMOLECULARBASISFORTHEREGULATIONONEXPRESSION,FUNCTIONANDLOCALIZATIONINSUBFRACTIONOFP16REMAINSPOORLYUNDERSTOODOURFINDINGSFORTHEINTERACTIONDIRECTLYOFAE1ANDP16PROVIDESEVERALNEWEVIDENCEFORTHEREGULATIONMECHANISMSITISIMPORTANTFORUNDERSTANDINGTHEPHYSIOLOGICANDPATHOPHYSIOLOGICSIGNIFICANCEOFP16ANDAE1WEINVESTIGATEDTHEEXPRESSIONOFP16,AE1ANDAE2PROTEININSIXCELLLINESWESTERNBLOTTINGSHOWEDTHATALLCELLLINESTESTEDNORMALLYEXPRESSEDAE2PROTEINHOWEVER,THEMKN45ANDSW1116,TWOGASTROINTESTINALTUMORCELLLINES,UNCONVENTIONALLYEXPRESSEDAE1PROTEIN,WHICHISABSENTINNORMALGASTRICORCOLONICTISSUEIMMUNOHISTOCHEMISTRYANDCELLFRACTIONATIONSHOWEDTHATAE2PROTEINISNORMALLYLOCALIZEDONCELLPLASMAMEMBRANE,HOWEVERAE1ANDP16PROTEINARELOCALIZEDINCYTOPLASMTHERESULTSUGGESTTHATTHECYTOPLASMICEXPRESSIONOFP16ISDUETOTHEABERRANTEXPRESSIONOFAE1TOINVESTIGATEWHETHERENDOGENOUSAE1ANDP16PROTEINSINTERACTWITHEACHOTHERINMKN45ANDSW1116CELLS,THECOIMMUNOPRECIPITATIONCOIPEXPERIMENTWASCARRIEDOUTHUMANAEISIMPORTANTFORREGULATINGPHOFCELLTHEPHIOFSINGLEMKN45ORSW1116CELLWASRECORDEDISHIGHERTHANTHATOFTHECELLWHICHDIDNOTEXPRESSAE1,3英文摘要SUGGESTINGTHATTHEREGULATIONOFPHIISABNORMALINTHETWOTUMORCELLSTHISRESULTCOULDQUERYAQUESTIONTHATTHECYTOPLASMICDISTRIBUTIONOFP16PROTEINMAYBEINDUCEDBYELEVATEDPHITOINVESTIGATEWHETHERTHEABERRANTP16DISTRIBUTIONINCELLULARSUBFRACTIONISPHDEPENDANT,THETWOTUMORCELLSWERECULTUREDINALOWPHMEDIAPHSTABLEAT60ANDTHECELLSWEREHARVESTEDANDNUCLEUSCYTOPLASMFRACTIONATIONWASPERFORMEDAFTERCULTUREFOR12,24AND48H,RESPECTIVELYTHEP16EXPRESSIONINWHOLEMKN45CELLSWASUPREGULATEDAT12AND24H,BUTDOWNREGULATEDAT48HAFTERTHECULTUREPHWASDECREASEDFROM74TO60THEUPREGULATIONOFP16WASNOTOBSERVEDINSW1116CELLSTHERESULTSDEMONSTRATEDTHATTHEP16DISTRIBUTIONINCELLULARSUBFRACTIONSISNOTPHDEPENDENT,BUTSEQUESTRATEDDIRECTLYBYAE1GENETICALTERATIONSOFP16ANDAE1WERENOTDETECTABLEOVEREXPRESSIONOFAE1INTHESECELLSSEQUESTRATEDMOREP16INCYTOPLASM,WHEREASSIRNAMEDIATEDSILENCINGOFAE1INTHECELLSINDUCEDRELEASEOFP16FROMCYTOPLASMTONUCLEUSLEADINGTOCELLDEATHANDGROWTHINHIBITIONOFTHETUMORCELLSBYANALYZINGTISSUESAMPLESOBTAINEDFROMGASTRICANDCOLONICCANCERPATIENTS,WEFOUNDTHAT8333GASTRICAND5652COLONICCANCERCOEXPRESSEDAE1ANDP16INCYTOPLASMUNLESSTHEP16ISDEFICIENTWECONCLUDETHATAE1PLAYSACRUCIALROLEINTHEPATHOGENESISOFGASTRICANDCOLONICADENOCARCINOMAANDTHATP16DYSFUNCTIONISANOVELPATHWAYOFCARCINOGENESISKEYWORDSANIONEXCHANGER1P16GASTRICADENOCARCINOMACOLONICADENOCARCINOMASIRNA4第一章前言第一章前言第一节阴离子交换蛋白1的研究现状阴离子交换蛋白1ANIONEXCHANGER,AE1基因位于17号染色体,整个基因长度18KB,包括20个外显子,CDNA序列长度4906个核苷酸,包括多聚A尾部,属于SLC4基因家族SLC4GENEFAMILY,该家族包括NA非依赖的电中性的CL/HCO交换蛋白,电中性的NA/HCO共传递蛋白,NA依赖的CL/HCO交换蛋333白。其中NA非依赖的电中性的CL/HCO交换蛋白又包括AE1,AE2,AE3,AE4,3统称AE家族。AE家族蛋白介导哺乳动物细胞普遍存在的CL/HCO跨膜交换过程,3进而调节细胞稳态、PH值、基因表达、细胞形态及代谢,在进化及细胞死亡过程中发挥重要作用。生理情况下,AE2和AE3广泛表达于脑,视网膜,心脏和胃。AE1主要表达在红细胞膜,其截断形式也表达在肾脏。一、AE1的结构AE家族成员都由三个结构域构成亲水性的N端胞质域疏水性跨膜域C端域,后两者被合称为膜段结构域,在三个家族成员中具有高度保守性70同源性,预测它14次贯穿于细胞膜,是迄今为止已知跨膜次数最多的膜蛋白质酸性的C端域是近年的研究热点。由于AE1丰富地表达在红细胞膜,容易获得,因此它一直是研究膜蛋白质结构与功能的经典模型。图1为AE1的拓扑结构。图1AE1拓扑结构示意图6第一章前言二、AE1的生物学功能1介导跨红细胞的CLHCO跨膜交换过程。3当血液流经组织时,红细胞携带的O与组织代谢产生的CO交换,CO弥散入222红细胞后与HO结合生成HCO,后者在碳酸酐酶IICAII的作用下解离为H与HCO2233,细胞内的HCO和胞外的CL发生跨红细胞膜的11电中性的交换CHLORIDE3SHIFT,或HAMBERGE移动。这种离子交换的结果是H在胞浆集聚,PH降低,使NH2及咪唑基等质子化,有利于盐键的形成,HB结构趋向紧密,从而降低HB与O2亲和力,氧离曲线右移促进血红蛋白释放更多的O供组织利用BOHREFFECT。2在这一过程中,CLHCO的交换是其中关键的步骤,如果没有红细胞AE13ERYTHROCYTEAE1,EAE1,动脉与静脉之间的CO差将降低30。22稳定红细胞膜及红细胞骨架。EAE1对红细胞膜的生物合成及功能至关重要。AE1与膜骨架相关联,红细胞膜骨架是位于质膜内表面的一薄片层网状结构,其首要作用是使红细胞有适当的抗冲击和变形能力。血影蛋白SPECTRIN是红细胞膜骨架的主要组成成分之一。在红细胞中血影蛋白由和亚单位组成四聚体,这种四聚体与短肌动蛋白纤维SHORTACTINFILAMENT,41蛋白PROTEIN41,肌球蛋白MYOSIN,原肌球蛋白TROPOMYOSIN,内收蛋白ADDUCIN,P55,49蛋白PROTEIN49相连组成交叉复合物JUNCTIONALCOMPLEXES。膜骨架通过两种方式于质膜相联一种是通过锚蛋白ANKYRIN将血影蛋白与AE1的N端胞质域1902039和317359残基结合,另一种方式是通过交叉复合物的组成蛋白41与穿膜的血型糖蛋白CGLYCOPHORINC相连。有研究表明ANKYRIN的缺失将引起红细胞形态,功能,寿命的变化,而血型糖蛋白C的缺少则对红细胞的形态,寿命影响较小。而蛋白42起着稳定ANKYRINAE1关联的作用。有文献表明EAE1的缺失使红细胞膜变得极不稳定,但AE1不是构成红细胞骨架所必须。业已证明,EAE1缺陷引起的遗传性球形红细胞症常伴随带42的减少,红细胞膜骨架稳定性降低。3调节血红蛋白的携氧能力。EAE1N端胞质域有血红蛋白HAEMOGLOBIN,HB的亲和位点。EAE1对脱氧HB的亲和力大于对氧合HB的亲和力。这种结合受PH的影响很大,研究显示酸性7第一章前言环境使HB与EAE1紧密结合,PH67时二者开始分开,这有利于组织中氧的释放和肺中氧与HB的结合。4调节和保护糖酵解酶的活性。EAE1N端域具有3磷酸甘油醛脱氢酶、醛缩酶、磷酸果糖激酶及过氧化氢酶的结合位点。不同的酵解酶之间竞争地与EAE1结合,结合后的酶活性降低或消失,这样,EAE1不仅调节糖酵解过程,而且通过与酵解酶结合而保护它们免受胞浆中蛋白酶的降解。这对红细胞很重要,因为成熟红细胞缺乏合成蛋白质所需的细胞器,需在120天左右的生命历程中维持原有酶的活性。在生理条件下,大约25的血红蛋白与EAE1结合,通过这些酶与蛋白质之间的相互作用,将氧运输和红细胞内的糖酵解联系起来,以适应细胞代谢需要。5与血型抗原A。EAE1可能充当了GPA的分子伴娘,二者相互协助在膜上定位。EAE1的这种作用是通过其GLU658和GPA中的碱性氨基酸形成电荷对实现的,GLU658LYS突变的EAE1失去结合GPA的能力,不能将其定位到膜上,因而红细胞膜上无GPA表B达的WR抗原。从人类红细胞膜纯化的EAE1C末端肽段19个氨基酸残基组成与血型蛋白A直接相互作用,该肽链显示一种新蛋白酶活性,能够特异地切断血型糖蛋白ALEU118SER119肽键,提示二者在蛋白质合成、膜转运及功能上的密切联系。迄今为止尚未发现其它已知的蛋白酶特异切断该肽键的报道。三、AE相关疾病1贫血红细胞在血管内循环流动,不断接受血流的摩擦和切应,作为红细胞膜主要蛋白质的EAE1正常的结构与功能是保证红细胞正常寿命的主要因素,当EAE1出现异常时,红细胞的刚性增强,变形能力下降,寿命缩短少于20万次循环,出现贫血。东南亚卵形红细胞症SAOSOUTHEASTASIANOVALOCYTOSIS是常染色体显性遗传病,是由基因阅读框架里面编码400408位氨基酸残基的序列发生缺失突变而导致的,此类突变的纯合子会导致胚胎期个体死亡的严重后果。含有杂合子突变的红细胞膜刚度增加,随着温度的降低会诱导膜对阳离子的通透性增加。另外一类AE1突变是常染色体显性遗传球形红细胞症也可由血影蛋白和锚蛋白突变所引起。这类突变使AE1MRNA不稳定,从而导致表达水平下降,幸运的8第一章前言是,这类病人的肾脏功能基本正常。2新的血型抗原数种EAE1胞外环状结构上的氨基酸的突变可产生新的血型抗原,如PRO548LEU,LYS551ASN,THR552ILE,VA557MET,GLY565ALA,PRO854LEU分别AAAAB产生RB,TR,WARR,WD,WU,DI,抗原,而GLU658LYS突变导致WR抗原的消失。3肾小管性酸中毒远端肾小管酸中毒DISTALRENALTUBULARACIDOSIS,DRTA是KAE1基因一系列突变引起的,几乎没有伴随的红细胞异常症状出现。DRTA导致泌尿代谢过程中酸的分泌失调,导致生长停滞,同时伴随着高钙尿和血钾过低。将远侧肾小管性酸中毒病人的AE1在爪蟾卵母细胞表达发现其CL/HCO交换功能正常或稍有下3降,不足以解释肾脏表型。研究发现,这种病人的AE1R589H突变体在内质网中与野生型的AE1结合形成异二聚体,这种异二聚体的产生使AE1转膜过程出现异常。AE1C末端的11个氨基酸残基缺失,由于缺少了904907的分类和回收信号,而使AE1在极化上皮细胞的基底膜和顶端膜过度累积。出现泌酸障碍。KAE1S773P的突变体由于不能很好地上膜运输,其表达只有野生型AE1的1/3,并且这种突变体不能很好地折叠,很容易被蛋白酶降解,寿命只有野生型的一半。KAE1的G609R突变体离子交换功能与野生型相比无明显差别,但无法正确定位到细胞膜发挥功能,因此出现严重的远端肾小管性酸中毒。4疟原虫侵袭在恶性疟原虫侵入红细胞时,必须要通过MSPMEROZOITESURFACEPROTEIN和AE1胞外两个非糖基化片段的相互作用才能顺利进入红细胞。AE1的这两个非糖基化片段作为宿主疟原虫相互作用的受体,其核心区域是720761和807826氨基酸残基片段。目前的看法是,MSPAE1间的相互作用是疟原虫附着于红细胞的初始步骤,因为MSP和AE1分别是疟原虫和红细胞表面最丰富的蛋白。随着疟原虫开始进一步的侵入过程,会有更多的疟原虫表面蛋白和AE1和GPA的其他片段相互作用,以完成整个侵入过程。MSPAE1间的相互作用为开发新的疟原虫疫苗提供了新靶点。5输血依赖的溶血性贫血9第一章前言EAE1基因第二内含子第二位的T突变为C,造成MRNA水平的错误剪接产生N端缺失11个氨基酸的带3蛋白新体NEAPOLIS。此种蛋白新体不能象正常AE1那样与醛缩酶结合,但是可以和其他糖酵解酶结合。带3蛋白新体不能被酪氨酸磷酸化,说明这开始的11个氨基酸残基是AE1酪氨酸磷酸化所必须的。膜上表达带3蛋白新体的红细胞对疟疾的抵抗力增强,说明这种AE1的缺陷可能对疟原虫的侵入起到阻碍作用。最新研究表明这种带3蛋白新体可造成严重输血依赖的溶血性贫血。第二节胃结肠腺癌发病机制的研究概况及目前存在的问题目前全世界胃癌90为腺癌每年的新发病例在所有恶性肿瘤中排第2或4位文献报道不一,有地域区别,而在肿瘤导致死亡的原因中则排第2位,早期诊断困难,5年生存率只有20,说明胃癌的治疗效果较之其它肿瘤欠佳。国际上公认的胃癌组织学类型有肠型高分化型,WELLDIFFERENTIATED和弥散型低分化型,POORDEFFERENTIATED。关于胃癌的诱发因素近年来取得了多方面的进展,其中比较重要的是幽门螺杆菌感染与胃癌发生的关系,尽管其诱发胃癌的机制并不清楚。有报道称在72的胃窦癌患者检出幽门螺杆菌,因此幽门螺杆菌是WHO认定的一级致癌原,但目前也受到质疑,因为在一些亚洲国家的胃癌患者与幽门螺杆菌感染的关系并不密切,另外,在很多正常人群中也能检测出幽门螺杆菌感染。此外,近年的研究还发现胃癌时一些分子水平的变化,其中包括CATENIN、KRAS、P53、SFRP及APC等。但始终未发现胃癌特异性的分子标志物。1993年YASUI等建立了胃肠道基因诊断系统,并应用于10000例临床病例的检测,我国多个学者报告他们建立了胃癌预警系统,其中包含200余个基因差异改变的检测,对胃癌的早期预警可能发挥一定作用。结肠癌是第3位导致癌症死亡的因素,而在美国排到了第2位。随着经济的发展及饮食模式的改变,我国恶性肿瘤的发病病谱也随之而异,下消化道的肿瘤呈现上升之态,主要是结肠癌的发病率逐年提升,FAP,HNPCC,但是绝大部分还是散发性的。多数结肠癌被认为是一个渐进的发展过程,从正常的上皮到腺瘤样息肉再发展成腺癌。近十几年来,结肠癌领域的最重要进展之一是已经认识到结10第一章前言肠肿瘤的产生是经历了一些基因逐步断裂的过程,而这些基因控制了细胞的复制、分化、凋亡及DNA的修复。目前很多与结肠癌产生有关的基因已经得到了充分的认识,诸如APC/BCATENIN,DCC,P53,KRAS和微卫星不稳定等均已被确定并进行临床前研究,但始终未发现散发性结肠癌特异性的分子标志物,因此对结肠癌的药物靶向治疗带来了一定的困难,到目前为止,临床上仍然以手术治疗为主。第三节本文的主要研究内容概述在过去几年中,本实验室在AE1的生物学功能以及表达调控方面都取得了可喜的研究进展,所在课题组在HEK293T细胞中进行的功能研究发现,P16和AE1之间的相互作用可以加快AE1的上膜过程,而AE1的过表达明显上调P16水平,进而抑制细胞的生长,这一研究结果揭示了P16和AE1蛋白的新生物学功能。AE1是继CDK4/CDK6之后发现的又一个与P16直接相互作用的蛋白质,无疑将为阐明AE1和P16的其它生物学功能提供实验基础。但全长AE1是一个红细胞膜特异表达的蛋白质,在其他正常组织未见表达,AE1和P16的相互作用的生理和病理意义有待进一步探讨。本研究工作主要包括如下三部分的内容第一部分在人类肿瘤细胞系和实体瘤中研究AE家族蛋白和P16蛋白的表达情况。第二部分AE1蛋白与P16蛋白的相互调节关系。第三部分过表达AE1和利用RNAI技术使AE1基因沉默后,P16蛋白在胃结肠癌细胞的定位变化以及对细胞的影响。上述研究工作较大地拓展了我们对于AE1功能的认识,将AE1拓展到消化道恶性肿瘤领域,对于认识胃结肠腺癌的分子机制,进而为早期诊断和治疗胃结肠腺癌的特异性分子靶标提供了重要实验依据。11第一章前言第二章在人类肿瘤细胞系和实体瘤中研究AE1蛋白和P16蛋白的表达情况第一节材料与方法一、试剂胎牛血清GIBCOBRL,GAITHERSBURG,MLDMEM培养基、RPMI1640培养基SIGMAALDRICH,STLOUIS,MO抗LAMINB多克隆抗体SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,SANTACRUZ,CAHRP鼠二抗、兔二抗CELLSIGNALING,BEVERLY,MAHRP羊二抗DAKO,A/S,DENMARK抗ACTIN抗体ONCOGENE,FREMONT,CADAPI4,6DIAMIDINO2PHENYLINDOLEMOLECULARPROBE,EUGENE,OR蛋白酶抑制剂SIGMA,STLOUIS,MO抗AE1的单克隆抗体SIGMA,STLOUIS,MO抗AE2的多克隆抗体ALPHADIAGNOSTICSINTERNATIONAL,SANANTONIO,TX抗P16的多克隆抗体SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,SANTACRUZ,CAFITC标记的兔二抗SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,SANTACRUZ,CATEXASRED标记的鼠二抗SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,SANTACRUZ,CA抗淬灭剂VECTORLABORATOTIES,BURLINGAME,CACHEMILUMINESCENCEPHOTOTOPEHRPKITCELLSIGNALING,BEVERLY,MADAB显色试剂盒迈新生物技术开发有限公司二、主要仪器设备CO培养箱SANYO,OSAKA,JAPAN2超净工作台苏州净化设备有限公司分析低温高速离心机HITACHI,TOKYO,JAPAN12第二章在人类肿瘤细胞系和实体瘤中研究AE1蛋白和P16蛋白的表达情况天平北京赛多利斯天平有限公司恒温摇床FORMA,MILFORD,MA分光光度计EPPENDOF,HAMBURG,GERMANY全自动洗片机DANAFORD,ROMSEY,CA荧光倒置显微镜LEICA,WETZLAR,GERMANY普通光学显微镜OLYMPUS,TOKYO,JAPAN紫外光密度分析仪上海复日公司匀浆器DOUNCER,FISHER/KONTESGLASSCO,PITTSBURGH,PADAKO笔DAKO,A/S,DENMARK隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司全自动包埋机LEICAEG1150H三、细胞与细胞培养所有的贴壁细胞系都用含10胎牛血清的DMEM培养基在含有5CO95O的培养箱中37培养。22所有的悬浮细胞系都用含10胎牛血清的RPMI1640培养基在含有5CO95O的培养箱中37培养。22所有细胞在实验期间,经台盼兰染色分析,细胞活力保持在90以上。四、蛋白印迹WESTERNBLOTTING61收集210细胞2用冷PBS洗两次,尽量弃去残余的PBS3用适量体积预冷普通裂解液SDS蛋白酶抑制剂混合物PROTEASEINHIBITORCOCKTAIL重悬细胞,95100煮5分钟,冰上置5分钟,重复两次,充分裂解细胞4将细胞裂解液412000G离心10分钟,上清液为抽取的总蛋白5蛋白定量后,将同等总蛋白量的不同处理样品进行1012SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳6电泳后转移蛋白到PVDF膜POLYVINYLIDENEFLUORIDE,PVDF13第二章在人类肿瘤细胞系和实体瘤中研究AE1蛋白和P16蛋白的表达情况7转好后的PVDF膜先用TBSTRISBUFFEREDSALINE配制的5脱脂奶粉室温封闭1小时8然后分别与抗AE1的单克隆抗体抗体,抗AE2的多克隆抗体,抗P16的多克隆抗体,抗ACTIN抗体,抗LAMINB多克隆抗体4孵育过夜9用辣根过氧化酶HORSERADISHPEROXIDASE,HRP标记的二抗室温孵育1小时10最后用CHEMILUMINESCENCEPHOTOTOPEHRPKIT检测蛋白表达变化。五、核浆分离方法71收集110细胞,用预冷的PBS漂洗2沉淀下来的细胞团块加入1ML的A液10MMHEPESPH79,15MMMGCL,210MMKCL,05MMDTT,冰上孵育10分钟32500RPM4离心2分种后弃去上清4加入A液02NONIDETP40NP40,蛋白酶抑制剂混合物COCKTAIL,A液400L快速振荡后5000RPM4离心1分种后收集上清液为细胞浆蛋白5沉淀用A液漂洗一遍后离心去上清6沉淀即为细胞核蛋白,其中加入150LSDS裂解液4SDS,10甘油,100NMTRISPH68,5巯基乙醇快速振荡,冰上裂解20分钟后95100煮5分钟,冰上置5分钟,重复两次,充分裂解细胞核蛋白712000G4离心10分钟收集上清液即细胞核蛋白。六、免疫荧光实验1将细胞接种于盖玻片上,用DAKO笔画出细胞的圆形边界,以下的每一步操作均在圈内进行2预冷的4多聚甲醛鼎国,北京,中国固定10分钟3用冰PBS洗后,用05TRITON穿孔4用冰PBS洗后加入3BSA室温封闭1小时5分别用人来源的抗AE1的单抗和抗AE2的多抗抗体1100混匀于3BSA中孵育60分钟14第二章在人类肿瘤细胞系和实体瘤中研究AE1蛋白和P16蛋白的表达情况6用PBS洗涤3次后加入TEXASRED标记的羊抗鼠的二抗1/100和FITC标记的羊抗兔的二抗1/100孵育45分钟7用PBS洗涤3次后加入DAPI孵育10分钟后再次用PBS清洗滴上抗淬灭剂VECTASHIELD,BURINGAME,CA后封片,用荧光倒置显微镜LEICA,WETZLAR,GERMANY观察并获取图像。七、免疫组化1石蜡切片二甲苯脱蜡至水21过氧化氢室温孵育20分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性3PBS冲洗,5分钟3次4抗原修复。将片子于1柠檬酸钠液PH60中开水煮20分钟再焖10分钟,取出冷却5510正常山羊血清PBS稀释封闭20分钟6分别加一抗鼠抗人AE1抗体11003BSA稀释和兔抗人P16抗体12003BSA稀释4过夜7PBS冲洗,5分钟3次,加二抗羊40分钟,PBS冲洗,5分钟3次8DAB显色,新鲜配制,显微镜下观察35分钟DAB,充分水洗,终止反应9自来水冲洗,苏木素复染。切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封片。八、总RNA的提取按照INVITROGEN公司TRIZOL试剂盒提供的方法提取细胞的总RNA。具体实验步骤如下61收集51010细胞MKN45或SW1116细胞,用1MLTRIZOL重悬细胞并反复吹打细胞以充分裂解2室温放置5分钟以充分裂解核蛋白复合体3按照每1MLTRIZOL加入02ML氯仿,剧烈震荡15秒,室温放置23分钟412000G,4离心15分钟5小心转移上层水相至另一离心管中,每1MLTRIZOL加入05ML异丙醇,充分缓慢混匀溶液后,室温放置10分钟沉淀RNA,12000G4离心10分钟15第二章在人类肿瘤细胞系和实体瘤中研究AE1蛋白和P16蛋白的表达情况6弃尽上清,每1MLTRIZOL加入1ML75乙醇,洗涤RNA沉淀。用涡旋振荡器短暂震荡数秒后,7500G4离心5分钟7干燥RNA沉淀,加入适量DEPC水溶解,80保存备用。九、RTPCRMKN45或SW1116细胞总RNA利用RTPCR试剂盒TAKARA,DALIAN,CHINA反转录成CDNA。反映程序按照3010分钟,5030分钟,995分钟,55分钟。201L反应体系包括2L10RTBUFFER,1LMGCL,2LDNTP,05LRNASEINHIBITOR,1LAMVREVERSETRANSCRIPTASE,1LRANDOM9MERS,2GRNA,RNASEFREE双蒸水补足20L。AE1全长的PCR分成三个片段AE1A代表0976,AE1B代表9301914,AE1C代表18002736,301L反应体系包括3L10KODBUFFER,12LMGSO4,3LDNTP,05L正向引物10M,05L反向引物10M,2LAE1CDNA模板,1LKODASE,188L双蒸水补足30L。P16全长的PCR301L反应体系包括3L10KODBUFFER,12LMGSO4,3LDNTP,05L正向引物10M,05L反向引物10M,2LP