猪链球菌的分离与鉴定

猪链球菌的分离与鉴定提交日期2010年3月目录摘要3关键词3前言31实验材料411病料412试剂413培养基414血清学试验415药敏纸片416试验动物42方法421病原分离422分离菌株的鉴定4221生化试验4222血清学鉴定423致病力及保护力试验5231菌落形成单位的测定5232致病力试验5233保护力试验5234细菌回收试验524药敏试验53结果731分离细菌的培养特性及形态特征7311培养特性7312染色特性732生化试验结果733血清学鉴定结果734致病力试验结果及保护力试验结果7341致病力试验结果735细菌回收试验结果836药敏试验结果84分析与讨论841猪链球菌STREPTOCCUSSUTS是危害养猪业的一种重要病原菌842猪链球菌病在临床上有败血型、脑膜脑炎型、关节炎型支气管炎型等843病猪和带菌猪是本病的重要传染源944从致病力试验结果可以看出9参考文献9致谢10猪链球菌的分离与鉴定作者肖维怡指导老师李德亮讲师（湖南农业大学动物科学学院，长沙410128）摘要2007年4月，湖南省攸县生猪繁育场仔猪流行关节炎和败血症。无菌条件下取患关节炎猪的关节液和患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结各8份病料，并对这16份病料进行病原菌分离试验、血清学鉴定、致病力试验、保护力试验、细菌回收试验、药敏试验。结果表明该病原菌为2型猪链球菌，引起关节炎的猪链球菌较引起败血症的猪链球菌致病力弱；该菌对头孢菌素、青霉素高度敏感。关键词猪链球菌分离鉴定前言猪链球菌STREPTOCOCCOSISSUIS是引起猪的多种疾病的病原菌之一。，该病原菌在养猪业发达国家如美、英、荷及爱尔兰等常有发生。我国于1958年就有猪链球菌病的报道，1976年我国南方几省曾一度广泛流行，给我国养猪业带来了很大危害。目前，发现的猪链球菌荚膜型已超过30种。我国于1995年首例鉴定证实2型猪链球菌的存在。猪链球菌可致26周龄仔猪败血症、脑膜炎、关节炎及支气管肺炎等。病猪和带菌猪是本病的重要传染源，病猪的鼻液、尿液、血液、肌肉、内脏和关节内均可检出病原体。未经无害处理的病死猪肉、内脏及废弃物是散播本病的重要原因，呼吸道是本病的主要传播途径。本病一年四季均可发生，但以410月份发生较多。本病常为地方性流行性，多呈败血性。短期波及全群，如不进行防治，则发病率、病死率很高，慢性常为地方性散发性传染。2008年4月，攸县生猪繁育场仔猪流行关节炎及败血症，多为26周龄仔猪。无菌采取关节炎病猪的关节液及败血症病猪的肝、脾、肺及肠系膜淋巴结，经实验室分离鉴定，证实为2型猪链球菌。现将分离鉴定结果报告如下。1实验材料11病料无菌采取攸县生猪繁育场患关节炎病猪的关节液8份，分别编号为18号；无菌采取患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结8份，分别编号为916号。12试剂试验所用的各种糖均购自上海化学试剂二厂，批号自20052007年不等。13培养基绵羊鲜血平板、匹克氏增菌液、10ML/L猪血清肉汤及各种糖培养基按常规方法制备。14血清学试验猪链球菌诊断血清与平板凝集抗原均购自中国兽药鉴察所，批号为990725。15药敏纸片购自广东省某军区后勤部，批号20000312。16试验动物健康小白鼠3035G50只，购自第四军医大学实验动物中心。2方法21病原分离将所采病料分别涂片，革兰氏染色镜检，然后分别接种于鲜血琼脂平板。37OC需氧培养24H后，挑取可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37OC培养24H后，革兰氏染色，显微镜检查，再接种于血清肉汤，纯化后放置4OC，冷藏备用。22分离菌株的鉴定221生化试验随机抽取上述分离菌血清肉汤培养物3、8、13、15，分别接种于蔗糖、山梨醇、棉实糖、葡萄糖、甘露糖、蕈糖、乳糖、菊糖、水杨苷、马尿酸钠培养基，37OC培养24H后，观察其对糖的利用情况。222血清学鉴定将3、8、13、15菌经缓冲肉汤培养8H，通过3000R/MIN离心10MIN，PBS洗涤2次，用PH72的001MOL/LPBS制成1101021010添加单位名称细菌悬液。取1滴上述细菌悬液与适当的抗血清在洁净玻片上混匀，立即观察凝集现象。同时，设立细菌悬液对照及血清对照。23致病力及保护力试验231菌落形成单位的测定1将已灭菌的营养琼脂培养基分别倒入已灭菌过的培养皿内，每皿约15ML培养基，启开皿盖暴露于无菌室内的不同地方，10MIN后，盖好皿盖。2将培养皿倒置于37OC培养24H后，观察菌落情况，统计菌落数。3如果每个皿内菌落不超过4个，则可以认为无菌程度良好，菌落数很多，则应对无菌室进一步灭菌，再重复以上步骤。232致病力试验无菌吸取上述血清肉汤培养物含菌量50108CFU/ML以01ML/只、02ML/只、03ML/只、04ML/只、05ML/只分别腹腔注射小白鼠2只，观察其死亡时间和数量，测定其最小致死量。再将上述血清肉汤培养物腹腔注射小白鼠，小白鼠共14只，分7组。第一组，每只小白鼠注射3菌02ML，第二组每只注射8菌02ML，第三组每只注射3、8菌各01ML，第四组每只注射13菌02ML，第五组每只注射15菌02ML，第六组每只注射13、15菌各01ML，第七组每只注射无菌血清肉汤10ML。以上各组分别饲养观察其死亡时间及数量。233保护力试验将3、8、13、15血清肉汤培养物分别接种于18CM鲜血平板。37OC培养24H后，收菌。再用麦氏比浊管比浊，适当稀释，然后用03甲醛灭活，37OC作用24H后做无菌检验。然后将其分别腹部皮下接种小白鼠2只，剂量为04ML/只。10天后，再分别进行人工感染，剂量为02ML/只。234细菌回收试验对致病力试验出现症状及死亡小白鼠剖检，并采集病料，进行分离。24药敏试验采用纸片扩散法，用无菌棉签蘸取分离菌的血清肉汤培养物，均匀涂布于9CM鲜血平板；待稍微干燥后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴在培养基表面，4OC、2H使药物扩散，然后置37OC培养2024H，观察结果。结果按抑菌圈直径大小和各抗菌药的具体标准，评定为高度敏感、中度敏感或耐药。结果评定参照表1。表1各种抗菌药物的抑菌圈与敏感标准3结果31分离细菌的培养特性及形态特征311培养特性37OC培养24H后，所采的12份病料在鲜血琼脂平板上形成表面光滑、隆起的灰绿色小菌落，外层有明显的溶血环。该菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉汤中先均匀浑浊，后在试管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。312染色特性关节液、鲜血琼脂、匹克氏增菌液及血清肉汤培养物涂片、革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阳性，在关节液、鲜血琼脂培养物中多呈单个、双球或短链状排列，在匹克氏增菌液及血清肉汤培养物中多呈长链状。32生化试验结果抑菌药物名称抑菌圈直径MM耐药单位名称中度/高度青霉素10101213土霉素10101415洁霉素10101415链霉素10101415庆大霉素12131415卡那霉素12131415头孢菌素10101515表2表明分离的3、8、13、15菌的生化反应结果均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的菌均为猪链球菌。表2分离菌生化试验结果鉴定项目蔗糖醇山梨糖棉实糖葡萄糖乳糖苷酸钠381315判定标准“”表示大多数（90100）菌株为阳性；“”表示大多数（90100）菌株为阴性。33血清学鉴定结果将3、8、13、15细菌悬液与1/2及2型抗血清混合，立即可见明显的凝集现象，但不与1型及其他型抗血清出现凝集。直接挑取细菌菌落与血清混匀，也能得到一致结果。阴性对照均未见凝集现象。34致病力试验结果及保护力试验结果341致病力试验结果第一组、第二组小白鼠注射血清肉汤培养物48H内均未见死亡，第三组48H内有一只死亡，第四组、第五组、第六组在注射血清肉汤培养物18H内全部死亡。死亡后，小白鼠皮肤发绀，剖检肝、脾、肺、心出血，呈败血症。第七组健活。由于第一、二、三组死亡数量非常少，所以，再用相同剂量分别背部皮下接种小白鼠各2只，48H后处死，剖检发现注射部位有直径0911CM的脓肿，浓汁呈黄绿色。糖、乳糖、菊糖、水杨苷、马尿酸钠培342保护力试验结果免疫的小白鼠再经攻毒后均未发病。342保护力试验结果缺内容35细菌回收试验结果将上述死亡及发病的小白鼠剖检采集病料，进行细菌分离、生化试验及血清学鉴定，能得到原分离菌。36药敏试验结果表3表明，结果敏感的药物依次是头孢菌素、青霉素；中度敏感的依次是洁霉素和卡那霉素；而对土霉素、链霉素、庆大霉素具有抗药性。表3药敏试验结果项目菌号头孢菌素青霉素洁霉素卡那霉素土霉素链霉素庆大霉素31915141387781816131386713191614137781519151314888平均值1875155135132577570754分析与讨论41猪链球菌（STREPTOCCUSSUTS）是危害养猪业的一种重要病原菌80年代初，加拿大由猪链球菌引起的疾病开始增加。那时仅检出9种夹膜血清型，其中2型是最常见的。请补充讨论内容42猪链球菌病在临床上有败血型、脑膜脑炎型、关节炎型支气管炎型等过去屡有败血型猪链球菌的报道，而关于集约化养猪场关节炎型链球菌病的报道较少。本次试验从患关节炎猪的关节液中成功的分离出了猪链球菌。另外，岐山种猪场，约有60的仔猪流行关节炎，严重者可发生败血症而死亡，给种猪场造成巨大的经济损失。所以，研究本病可为生产中防制本病提供理论依据。43病猪和带菌猪是本病的重要传染源病猪的鼻液、尿液、肌肉、内脏和关节内均带有病原体，所以，我们建议，首先应加强对健康猪的免疫。另一方面，在发病后，加强病猪和健康猪的隔离，根据实验室所做的药敏试验结果，配合药物治疗，建议用头孢菌素、青霉素、洁霉素等药物治疗。岐山县种猪繁育场采纳我们的建议后，首先对所有的未发病仔猪用灭活疫苗免疫接种，对已发病的猪用青霉素等药物配合治疗。另外，注意卫生管理。目前该病已得到有效的控制。44从致病力试验结果可以看出引起猪关节炎的猪链球菌的致病力较小，而引起败血症的猪链球菌的致病力较强。但通过生化试验和血清学鉴定，它们又是同种细菌且血清型也相同。为什么同种血清型的猪链球菌的致病力差别很大这个问题还有待于进一步研究。参考文献（在文章正文中应标出，前后要一直）1杨本升，刘玉斌，苟仕金等动物微生物学吉林科学技术出版社，19952张庚华猪链球菌感染最新研究进展国外兽医学畜禽疾病，1995，16（2）313黄毓茂,黄引贤2型猪链球菌的血清学鉴定中国兽医学报，1995，15（1）63654GOTTSCHALKMJCLINMICROBIOL，1989，27263326365HIGGINSRETALCANJVETRES，1990，541701736SANFORDSEJAVMA，1982，1816736767WIADSORVETREC，1977，1013783798李健强兽医微