药学专业毕业论文 任务书 开题报告 文献综述 外文翻译15

药学专业毕业论文任务书开题报告文献综述外文翻译15本科毕业论文设计手册届题目利用胡萝卜悬浮细胞表达AFGF的研究学院专业药学学号姓名指导老师职称合作老师职称目录中文摘要6外文摘要7引言81实验材料与试剂811实验材料及试剂8COM植物材料8COM菌株和质粒812主要试剂913仪器92实验方法1021培养基的配制及培养条件10COM有机母液配制10COMB培养基配置方法11COMYEB培养基配置方法1122目的基因的修饰与改造11COM修饰改造过程中所需引物11COM反应体系11COM第二轮反应体系11COM第三轮反应体系1223PMHP0FGF21载体的构建1224连接产物转化大肠杆菌感受态细胞1225质粒DNA提取1326无菌外植体的获得1327农杆菌介导法的遗传转化1328转化体的筛选鉴定143结果1431植物表达载体的构建1432胡萝卜悬浮细胞的转化及单克隆筛选1533抗性细胞单克隆培养1634阳性胡萝卜细胞的GUS检测1635AFGF蛋白检测174讨论175总结17参考文献18致谢AFGF的研究摘要是一来源于中胚层及神经外胚层细胞有广泛促分裂作用为了降低AFGF的生产成本植物生物反应器的优点AFGF在中的表达进行了探索AFGF胡萝卜细胞表达AFGF克隆到胡萝卜通过检测及WESTERNBLOTTING检测AFGF胡萝卜悬浮细胞植物生物反应器THESTUDYONAFGFEXPRESSIONUSINGCARROTSUSPENSIONCELLSABSTRACTDERIVEDFROMMESODERMANDNEURALECTODERMCELLSACIDFIBROBLASTGROWTHFACTORAFGFHASEXTENSIVEMITOGENICEFFECTSALTHOUGHITISVERYEXPENSIVEINORDERTOREDUCETHECOSTOFPRODUCTIONANDTOMAKEFULLUSEOFTHEMERITSINTEGRATEDWITHPLANTBIOREATORWEHAVEEXPLOREDTHEAFGFINTRANSGENICTOBACCOEXPRESSIONTHISSTUDYCONSTRUCTEDAAFGFEXPRESSIONVECTORINCARROTCELLSUSEINGPLANTTRANSGENICTECHNOLOGYTHEAFGFWASCLONEDINTOTHEEXPRESSIONCARROTSUSPENSIONCELLSBYTHEMETHODOFAGROBACTERIUMINOCULATIONTHERESULTSOFDOTPCRANDWESTERNBLOTTINGSHOWTHATTHEDESIREDFRAGMENTWASSUCCESSFULLYTRANSFERREDINTOTHEPLANTCELLSANDTHEPROTEINWASEXPRESSEDINMEDIUMKEYWORDSAFGFCARROTSUSPENSIONCELLPLANTBIOREACTOR引言人酸性成纤维细胞生长因子ACIDICFIBROBLASTGROWTHFACTORAFGF是成纤维细胞生长因子家族的重要成员1人的AFGF基因位于第4号染色体上为单拷贝基因由两个大的内含子和3个外显子组成2AFGF主要分布于大脑它以自分泌或旁分泌的方式作用于周围细胞但其本身缺乏信号肽结构3AFGF蛋白由154个氨基酸残基组成等电点57通过与其受体结合启动信号转导机制从而诱导多种细胞分化增殖4AFGF在治疗帕金森综合症急性脊柱扭曲性损伤断指中神经功能重建脑缺血肾缺血心肌梗塞闭塞性脉管炎视网膜缺血胃溃疡及难愈合性伤口等多种临床应用方面具有巨大潜力5据统计我国仅烧伤年发生率为2即每年约有2200万人遭受不同程度烧伤其中约5烧伤病人需要住院治疗是不可忽略的社会问题同时难愈合溃疡如脉管炎引起的下肢溃烂糖尿病人的溃疡创面淋巴结核病人的溃疡创面各种术后感染的不愈合创面致使病人常年忍受精神上的痛苦和心理上的折磨据估计加拿大150万糖尿病患者中有15的病人将发生足部溃疡截肢术率高于85其原因是目前还没有特效药进行根治研究表明HAFGF有着广泛的生物学活性它能促进神经再生对神经元具有营养支持作用在中枢神经系统创伤修复中起重要作用在血管生成创伤修复等方面亦具有重要的作用68因此开发重组成纤维细胞生长因子不仅有重要的医学价值而且有很高的社会效益和经济效益若加上新的适应症开发其经济效益将更加可观9生物技术的迅猛发展特别在植物基因工程领域获得的研究进展使植物在药品生产方面的地位更加重要并将植物的应用范围拓展到原有的界限之外传统药用蛋白的生产主要采用微生物和哺乳细胞表达系统与利用微生物发酵和动物细胞组织培养生产药用蛋白相比植物生产体系具有生产成本比较低能进行有效的蛋白翻译后加工安全性好植物属可再生资源等特点10因此本实验拟通过构建AFGF胡萝卜悬浮细胞表达载体探讨利用植物悬浮细胞生产AFGF的可能性COM植物材料胡萝卜种子杭州安瑞普生物有限公司赠送COM菌株和质粒1菌株大肠杆菌菌株大肠DH5由本实验室保存农杆菌菌株农杆菌LBA4404由本实验室保存2质粒PMHP0和P1390YOFGF2112主要试剂本实验中主要用到的试剂如表1所示表1实验试剂及品牌试剂名称购买公司DNAMAKERDL2000ECORIPSTI等限制性内切酶T4DNA连接酶TAQDNA聚合酶大连宝生物生物工程有限公司胶回收试剂盒质粒小提试剂盒质粒PCR产物纯化试剂盒购自天根公司琼脂糖购自上海国药集团HYGROMYCIN潮霉素B购自BOEHRINGERMANNHEIM公司CEFOTAXIMESODIUM头孢霉素XGLUCGUS染液各种植物激素乙酰丁香酮购自SIGMA公司其它进口或国产分析纯试剂13仪器本实验过程中用到的主要仪器见表2表2仪器名称及型号超净工作台SWCJZFD型金坛市江南仪器厂HH4MICROCL17PCR仪THERMOMYCYCLER型MEDIA电子天平METTLERTOLEDOAL204恒温振荡器ZHWY2008电泳仪LKB2219型KS4000型PGX35013型10L100L1000L微量移液器德国EPPENDORF公司2实验方法21培养基的配制及培养条件COM有机母液配制按表3所示浓度配置有机物母液表3有机物母液浓度及放大倍数名称工作浓度MGL浓缩倍数贮存浓度GL烟酸05100005VB1盐酸硫胺素01100001VB6盐酸吡哆醇05100005甘氨酸210002肌醇10010010COM植物激素与抗生素MGML配制方法除菌方法贮存条件KT11MOLHCLDDH20022UM膜过滤20长期24D11MOLNAOHDDH20022UM膜过滤20长期RIF100二甲基亚砜无菌操作20三个月STR100DDH20022UM膜过滤20长期壮观霉素100DDH20022UM膜过滤20三个月KAN100DDH20022UM膜过滤20长期COMMS培养基的配置方法配制培养基时每升培养基中加入433GMS粉加入30G蔗糖和7G琼脂粉先加入MS粉蔗糖按所需用量吸取有机母液加入用所需水溶解定容后装入三角瓶加入琼脂粉用1MOLLNAOH调PH至5860高压灭菌后待培养基温度降至50左右无菌操作加入所需激素倒板备用COMLB培养基配置方法以100ML为例加1G蛋白胨05G酵母粉10GNACL15G琼脂粉用超纯水定容至100MLCOMYEB培养基配置方法以100ML为例加05G蛋白胨01G酵母粉05G牛肉浸膏05G蔗糖04GMGSO47H2O15G琼脂粉用超纯水定容至100ML22目的基因的修饰与改造COM修饰改造过程中所需引物AFGFP15CAGTCTTCGTTTCGAACAGCGCTAACTACAAGAAGCCAAAG3FGFP25CGGAATTCTTAATCAGAAGAAACTGGCAATG3TPAP15AAAACTGCAGGCAACCATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTG3TPAP25AGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGAACAGC3COM第一轮反应体系L10BUFFER5DNTP4引物1AFGFP105引物2AFGFP205模板P1390YOFGF21质粒05STAR05水39TOTALVOLUME50COM第二轮反应体系见表6表第轮反应体系COMPONENTVOLUMEL10BUFFER5DNTP4引物1TPAP205引物2AFGFP205模板上轮回收质粒05STAR05水39TOTALVOLUME50COM第三轮反应体系见表7表第轮反应体系COMPONENTVOLUMEL10BUFFER5DNTP4引物1TPAP105引物2AFGFP205模板上轮回收质粒05STAR05水39TOTALVOLUME5023PMHP0AFGF载体的构建将经过三轮PCR扩增的产物经过纯化试剂盒纯化回收将纯化好的产物进行ECORIPSTI双酶切后胶回收PMHP0进行ECORPSTI双酶切后胶回收大片段将回收的大片段与目的基因片段连接过夜24COM细胞的制备利用TSS法进行大肠杆菌感受态的制备其中2TSS液的配置方法为称取2GPEG60008000加1ML1MOLLMGCL2或0203GMGCL26H2O再加1MLDMSO用水10MLPH至6165TSS法1挑单菌落于5MLLB中37振荡培养过夜2110037220RPMOD04053OD0405的菌液以及新鲜的LB培养基TSS液在冰上预冷510MIN41ML菌液到灭菌的EP管中41500G5MIN去上清550L预冷的LB培养基重悬650L2TSS液快速轻柔混匀30MIN80保存COMNA转化感受态细胞10L重组DNA加入100L感受态细胞中冰浴30MIN42水浴热激90S再冰浴5MIN加入500LLB培养基37大肠杆菌28农杆菌振荡培养14H涂板37培养箱倒置过夜第二天挑取单菌落进行PCR鉴定25质粒DNA提取操作见质粒小提试剂盒说明质粒PCR鉴定送大连宝生物有限公司测序鉴定结果正确后将质粒转入农杆菌进行下步转化26无菌外植体的获得将胡萝卜种子搓去种毛冷水浸泡1H在超净工作台中于75乙醇中消毒90S无菌水冲洗35次每次12MIN20次氯酸钠01吐温灭菌15MIN无菌水冲洗35次每次12MIN无菌滤纸吸干水分接种到含12MS培养基中每瓶接种15颗种子培养条件2526先暗培养3天后转入光照培养箱光照12HD光强2000LX选取苗龄为68天的无菌苗为外植体27农杆菌介导法的遗传转化COM农杆菌的培养1含50MGLRIF50MGLSTR100MGL壮观霉素23天25MLYEB液体培养基中50MGLRIF50MGLSTR100MGL壮观霉素283236HCOM农杆菌感染外植体1先将无菌苗的下胚轴切为0305CM大小在含10MGL24D05MGL6BA的MS培养基上预培养2天2将OD为05左右的农杆菌离心后用MS30GL蔗糖培养基重悬将预培养的外植体浸入菌液中并在菌液中加入AS100UMOLL摇床上缓慢摇动15MIN3农杆菌与外植体共培养将外植体从菌液中取出在无菌滤纸上吸干晾晒一会后移入共培养基MS10MGL24D05MGL6BA100UMOLLAS培养基上覆盖一层无菌滤纸共培养2天4抗性愈伤组织的筛选共培养2天后移入筛选培养基MS10MGL24D05MGL6BA8MGLHYG500MGLCAR待愈伤组织长出后继代约23周继代一次继代两次28转化体的筛选鉴定COMUS基因的表达将待测定的愈伤组织浸入适量XGLUC溶液于373H观察拍照保存COM检测1愈伤组织总DNA提取参照快捷植物基因提取试剂盒说明书2PCR扩增F21P1F21P2为引物进行PCR扩增扩增反应条件94预变性5MIN94变性30SEC55退火30SEC7230SEC25个循环72延伸3MIN3电泳检测配制10的琼脂糖凝胶5VCM电压下电泳1520MIN以DL2000的DNAMARKER为标准分子量检测扩增片断大小质粒P1390YOFGF21为阳性对照模板非转化体DNA为阴性对照模板凝胶成像记录电泳结果3结果31植物表达载体的构建5端和3端加上了ECORIPSTIECORIPSTIPCR克隆的时候碱基没有发生突变图AFGF第一轮PCR图AFGF第二轮第三轮PCR图3大肠杆菌质粒PCR鉴定32胡萝卜悬浮细胞的转化及单克隆筛选COM利用抗生素筛选单克隆结果在培养基上得到多个具有抗生素抗性的单克隆见图3这说明利用该方法进行转化转化率较好图胡萝卜悬浮细胞的单克隆培养及筛选33抗性细胞单克隆培养挑取抗性单克隆于24孔板中1MLMS培养基8MGL潮霉素B27黑暗条件下振荡共培养5天左右取样12000RPMMIN离心5MIN取上清进行DOT检测结果表明图5中颜色比较浅的是未生长的显假阳性颜色深生长密度大的说明是抗性的图524孔板中单克隆悬浮培养34阳性胡萝卜细胞的GUS检测挑选3个单细胞克隆系进行GUS活性检测结果如图6所示3个细胞系都呈阳性反应说明P0质粒中的可转移区成功地整合到了植物的基因组中图6阳性胡萝卜细胞的GUS活性检测35AFGF蛋白检测SDS蛋白电泳结果表明在20KD出有蛋白条带说明目的基因在胡萝卜细胞中能够表达图74讨论建立高效稳定的植物组织培养的再生系统是植物转基因研究的前提植物品种不同外植体类型的不同培养基中激素种类浓度的不同等都会影响诱导愈伤组织的频率12AFGFPCR结果证实目的基因已经插入到了胡萝卜的基因组DNA中通过将外源基因编码蛋白TPA序列融合表达来实现AFGF的分泌表达当蛋白序列分泌到位于农杆菌细胞膜与外膜之间周质时可以引导蛋白质穿过细胞膜自身被信号肽酶水解释放出功蛋白此外有利于目的蛋白的纯化为转基因植物生产药物提供了新的思路和发展前景5总结本文通过植转基因的手段将AFGF克隆到胡萝卜悬浮细胞中进行表达实验结果表明AFGF成功转入到植物基因组中各种鉴定方法的结果表明该基因能够在植物细胞中进行表达后续分离纯化工作需要进一步的完成KOWALEWSKIRMALKOWSKIASOBOLEWSKIKETALEVALUATIONOFAFGFBFGFANDFGFSIGNALINGPATHWAYINTHEWALLOFVARICOSEVEINSJJSURGRES200915511651722WANGWPQUICKDBALCERZAKSPETALCLONINGANDSEQUENCEANALYSISOFTHEHUMANACIDICFIBROBLASTGROWTHFACTORGENEANDITSPRESERVATIONINLEUKEMIAPATIENTSJONCOGENE199169152115293RAJALINGAMDGRAZIANIIPRUDOVSKYIETALRELEVANCEOFPARTIALLYSTRUCTUREDSTATESINTHENONCLASSICALSECRETIONOFACIDICFIBROBLASTGROWTHFACTORJBIOCHEMISTRY20074632922592384FUXBLIXKWANGTETALENHANCEDANTIAPOPTOSISANDGUTEPITHELIUMPROTECTIONFUNCTIONOFACIDICFIBROBLASTGROWTHFACTORAFTERCANCELLINGOFITSMITOGENICACTIVITYJWORLDJGASTROENTEROL2004DEC151024359035965王仁厚王兴智利用转基因番茄表达人酸性成纤维细胞生长因子AFGFJ分子植物育种2003134254266付小兵田惠民盛志勇酸性成纤维细胞生长因子AFGF能减轻急性缺血与再灌流对骨骼肌的损伤解放军医学杂志J199520295977李亦武李贵玲李玥等重组人酸性成纤维细胞生长因子促进烧伤与愈合作用的研究药物研究J200524119789808STEEDDLGOSLENJBHOLLOWAYGAETALRANDOMIZEDPROSPECTIVEDOUBLEBLINDTRIALINHEALINGCHRONICDIABETICFOOTULCERSCT102ACTIVATEDPLATELETSUPERNATANTTOPICALVERSUSPLACEBOJDIABETESCARE19921511159816049李秀霞付小兵酸性成纤维细胞生长因子及其受体研究进展翁立新J中国危重病急救医学200416425325610FISCHERRANDEMANSNMOLECULARFARMINGOFPHARMACEUTICALPROTEINSJTRANSGENICRES200094527929911林J畜禽业20055202312WANDELTCLKHANMRLCRAIGSETALVICILINWITHCARBOXYTERMINALKDELISRETAINEDINTHEENDOPLASMICRETICULUMANDACCUMU2LATESTOHIGHLEVELSINTHELEAVESOFTRANSGENICPLANTSJPLANTJ1992218119213HUAZHHUANGDNGENETICMODEOFEXOGENESINTRANSGENICPLANTSJACTABOTSIN1999411514MCCORMICKAAKUMAGAIMHHANLEYKETALRAPIDPRODUCTIONOFSPECIFICVACCINESFORLYMPHOMABYEXPRESSIONOFTHETUMORDERIVEDSINGLECHAINFVEPITOPESINTOBACCOPLANTSJPROCNATLACADSCIUSA200796270370515HIATTAANTIBODIESPRODUCEDINPLANTSNATURE2005344469471致谢本科毕业论文设计任务书学院专业药学姓名学号指导老师职称合作老师职称论文题目利用胡萝卜悬浮细胞表达AFGF一课题的内容和任务要求研究内容载体的构建胡萝卜悬浮细胞的遗传转化阳性克隆的筛选和鉴定任务要求1通过查阅国内外相关资料了解国内外FGF的发展历程与应用现状2熟悉利用胡萝卜悬浮细胞表达FGF操作流程注意事项3掌握多步PCR构建植物表达载体农杆菌介导转化胡萝卜悬浮细胞以及相关的电泳DOT杂交以及WESTERN杂交的实验原理及技术二进度安排起止时间2010年9月27日2011年4月11日1完成实验流程得出实验结果2010年9月27日2010年12月4日2确定毕业论文设计题目拟定论文设计初步方案方案论证导师提出毕业论文设计期间咨询方式及具体联系时间2010年12月4日2010年12月25日3外文文献翻译及原稿查询2010年12月25日2011年1月4日4撰写毕业论文设计文献综述2011年1月4日14日5撰写毕业论文设计开题报告2011年1月15日25日6填写毕业论文设计任务书2011年1月26日29日7填写毕业论文设计进度表2011年1月30日2月7日8学生填写中期检查表准备论文中期检查2011年2月20日25日9毕业论文选题收集含上缴毕业论文题目文献综述开题报告论文任务书论文进度表2011年3月1日前10撰写毕业论文完成初稿2010年12月初2011年3月31日11毕业论文初稿上交论文带教老师审阅2010年4月1日10日12毕业论文电子稿和纸制稿一式一份上交学院办2011年4月11日1傅红J天津医科大学学报20051111451482高书颖郭蔼光金伟波等利用转基因植物生产药用蛋白研究进展J西北植物学报2003236104410483RAINERFJORGERDTOWARDSMOLECULARFARMINGINTHEFUTUREMOVINGFROMDIAGNOSTICPROTEINANDANTIBODYPRODUCTIONINMICROBESTOPLANTSJBIOTECCOMHEM1999301011084RAINERFCARMENVMTOWARDSMOLECULARFARMINGINTHEFUTURETRANSIENTPROTEINEXPRESSIONINPLANTSJBIOTECCOMHEM1999301131165FULLNERKJLARAJCNESTEREWPILUSASSEMBLYBYGROBACTERIUMTDNATRANSFERGENESJSCIENCE1996273110711096王关物基因工程原理与技术M第1版19982337BOYNTONJEGILLHAMNWHARRISEHETALCHLOROPLASTTRANSFORMATIONINCHLAMYDOMONASWITHHIGHVELOCITYMICROPROJECTILESJSCIENCE1988240153415388STAUBJMGARCIABGRAVESJETALHIGHYIELDPRODUCTIONOFHUMANTHERAPEUTICPROTEININTOBACCOCHLOROPLASTSJNATBIOTECHNOL2000183333389RUFSSTABLEGENETICTRANSFORMATIONOFTOMATOPLASTIDSANDEXPRESSIONOFAFOREIGNPROTEININFRUITJNATUREBIOTECHNOLOGY200119987087510林炳英林德钦李梅等基因植物生产药用蛋白的研究进展J福建农业学报2007221949911VERWOERDTCPARIDONPAOOYENAJETALSTABLEACCUMULATIONOFASPERGILLUSNIGERPHYTASEINTRANSGENICTOBACCOLEAVESPLANTPHYSIOL1995109119912蔡绍展J国医药工业杂志200435956156513SHARMAAKSHARMAMKPLANTSASBIOREACTORSRECENTDEVELOPMENTSANDEMERGINGOPPORTUNITIESBIOTECHNOLADV20092768113214曾作用J20105273315凌展J中国生物工程杂志2002225212616李J安徽农业科学200937241140311404签名栏学生指导老师学院领导本科毕业论文设计开题报告学院专业姓名学号指导老师职称合作老师职称论文题目利用胡萝卜悬浮细胞表达AFGF题目性质实验研究技术开发工程设计应用型调查型其他一选题依据和目标酸性成纤维细胞生长因子AFGF是来源于中胚层和神经外胚层细胞的致裂原它对多种组织和神经系统的损伤具有快速修复作用同时它又是一种神经营养因子因此对各种创伤烧烫伤溃疡神经损伤等多种疾病具有良好的诱导作用在临床应用中对骨骼系统有促进生成大量的成骨细胞抑制破骨细胞治疗骨质酥松股骨头坏死关节炎风湿病和因钙缺乏导致的疾病对消化系统有加强胃肠功能促进消化酶的分解增进食欲治疗慢性胃炎对血液系统有加强骨髓造血功能促进干细胞生成进而生成大量红细胞和白细胞加强左心室厚度增强心肌弹性力高效治疗心脏病有效清除血液中低密度蛋白防止在血管壁沉积治疗血栓因为以发酵的方式可快速高效地表达目的蛋白具有简便快捷经济的优点所以采用大肠杆菌表达系统表达重组AFGF是获取AFGF的重要方法采用这种系统表达AFGF时遇到的一个主要问题是容易产生包涵体使给产物的分离纯化带来难度回收率降低生产成本上升而重组蛋白的表达量低下更是迫切的要寻找新的表达体系利用转基因植物来表达AFGF作为一种新型的表达体系具有微生物和动物所不具备的独特优点1植物细胞具有全能性与动物细胞培养相比培养条件简单且易于活能够再生植株有利于遗传操作2转基因植物中外源基因可通过植物杂交的方法进行基因重组进而在植物体内积累多基因3转化植株系的种子易于贮存有利于重组蛋白的生产和运输4用动物细胞生产重组蛋白可能污染动物病毒对人类有潜在危害而植物病毒不感染人类比较安全5作为真核生物植物细胞有与动物细胞相似的结构和功能能够完成重组蛋白的正确装配和表达6可以避免微生物生产药物所带来的有害产物7植物是自养生物不需外加有机营养物即可完成物质的生产故生产成本比较低有利于大规模生产本研究拟通拟构建AFGF植物表达载体对胡萝卜悬浮细胞进行转化并通过抗生素筛选并获得稳定表达的细胞株本研究一方面有利于解决目前FGF传统生产方法的缺陷以及临床上对FGF需求量激增的困境另一方面也对传统农业的现代化作出贡献1植物表达载体的构建2成功利用农杆菌转化胡萝卜悬浮细胞获得稳定遗传的整合有目的基因片段的植物细胞3单克隆细胞系的获得及其鉴定三完成该课题研究已具备的条件有关的研究工作基础仪器设备条件经费情况本研究的实验部分是在生物与天然药物研究院进行的实验室具备PCR实验理论的发展和成熟为载体构建提供坚实的基础利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化油菜子叶和下胚轴本研究团队已有丰富的经验已在其他植物研究中具有成功的经历不存在技术风险指导老师及其课题组在转基因植物研究为本课题的开展奠定良好的基础条件和加速相关科研成果的产业化取得良好的经济和社会效益本课题的经费来自于温州市科技局项目5本毕业设计所涉及的实验部分将在生物与天然药物研究院进行该实验室具备从事本项目研究所需的设备条件拥有基因表达发酵蛋白纯化细胞分离与培养生物材料制备与检测植物组织培养植物分子育种等系统的仪器设备拥有流式细胞仪PCR仪发酵装置高速冷冻离心机紫外分光光度计分离纯化设备二氧化碳培养箱LKB多用电泳仪酶标检测仪荧光显微镜高效液相色谱仪超声波清洗器电子天平紫外透射反射分析ELGA超纯水系统全自动酶标仪离心冷冻干燥系统快速蛋白液相色谱系统倒置显微镜高压电泳仪层析设备高温高压灭菌器冷冻干燥仪DNA测序仪固液相分子杂交仪超低温冰箱85细胞培养室基因枪真空凝胶干燥器紫外透射仪日本OLYMPUS显微镜低温层析柜大型光照培养箱400立升10台高低压电泳仪各数台大小型恒温摇床各1台凝胶成像仪UVPDNA杂交仪高中压液相层析工作站等价值1000万元的设备1完成实验流程得出实验结果2010年9月27日2010年12月4日2确定毕业论文设计题目拟定论文设计初步方案方案论证导师提出毕业论文设计期间咨询方式及具体联系时间2010年12月4日2010年12月25日3外文文献翻译及原稿查询2010年12月25日2011年1月4日4撰写毕业论文设计文献综述2011年1月4日14日5撰写毕业论文设计开题报告2011年1月15日25日6填写毕业论文设计任务书2011年1月26日29日7填写毕业论文设计进度表2011年1月30日2月7日8学生填写中期检查表准备论文中期检查2011年2月20日25日9毕业论文选题收集含上缴毕业论文题目文献综述开题报告论文任务书论文进度表2011年3月1日前10撰写毕业论文完成初稿2010年12月初2011年3月31日11毕业论文初稿上交论文带教老师审阅2010年4月1日10日12毕业论文电子稿和纸制稿一式一份上交学院办2011年4月11日五参考文献1傅红J天津医科大学学报20051111451482高书颖郭蔼光金伟波等利用转基因植物生产药用蛋白研究进展J西北植物学报2003236104410483RAINERFJORGERDTOWARDSMOLECULARFARMINGINTHEFUTUREMOVINGFROMDIAGNOSTICPROTEINANDANTIBODYPRODUCTIONINMICROBESTOPLANTSJBIOTECCOMHEM1999301011084RAINERFCARMENVMTOWARDSMOLECULARFARMINGINTHEFUTURETRANSIENTPROTEINEXPRESSIONINPLANTSJBIOTECCOMHEM1999301131165FULLNERKJLARAJCNESTEREWPILUSASSEMBLYBYGROBACTERIUMTDNATRANSFERGENESJSCIENCE1996273110711096王关物基因工程原理与技术M第1版19982337BOYNTONJEGILLHAMNWHARRISEHETALCHLOROPLASTTRANSFORMATIONINCHLAMYDOMONASWITHHIGHVELOCITYMICROPROJECTILESJSCIENCE1988240153415388STAUBJMGARCIABGRAVESJETALHIGHYIELDPRODUCTIONOFHUMANTHERAPEUTICPROTEININTOBACCOCHLOROPLASTSJNATBIOTECHNOL2000183333389RUFSSTABLEGENETICTRANSFORMATIONOFTOMATOPLASTIDSANDEXPRESSIONOFAFOREIGNPROTEININFRUITJNATUREBIOTECHNOLOGY200119987087510林炳英林德钦李梅等基因植物生产药用蛋白的研究进展J福建农业学报2007221949911VERWOERDTCPARIDONPAOOYENAJETALSTABLEACCUMULATIONOFASPERGILLUSNIGERPHYTASEINTRANSGENICTOBACCOLEAVESPLANTPHYSIOL1995109119912蔡绍展J国医药工业杂志200435956156513SHARMAAKSHARMAMKPLANTSASBIOREACTORSRECENTDEVELOPMENTSANDEMERGINGOPPORTUNITIESBIOTECHNOLADV20092768113214曾作用J20105273315凌展J中国生物工程杂志2002225212616李J安徽农业科学200937241140311404六指导老师意见论文选题符合专业培养目标能够达到综合训练目标题目有难度工作量较大选题具有学术研究参考价值实践指导意义该生查阅文献资料能力较强能较为全面收集关于考试系统的资料参考了较为丰富的文献资料其时效性较强未发现抄袭现象签名年月日七学院意见学院负责人签名年月日本科毕业论文设计文献综述学院专业药学姓名学号指导老师职称合作老师职称文献综述题目利用胡萝卜悬浮细胞表达AFGF的研究文献综述植物生物反应器生产药用蛋白的研究摘要综述了国内外植物生物反应器生产药用蛋白的研究现状发展趋势以及生产药用蛋白的基本方法尽管目前植物作为生物反应器有许多因素限制优点与问题并存但利用转基因植物生产药用蛋白是植物基因工程研究领域的一个新的发展趋势关键字植物生物反应器转基因植物药用蛋白PLANTSASBIOREACTORFORTHEPRODUCTIONOFPHARMACEUTICALPROTEINSABSTRACTITSUMMARIZESTHEPRESENTSTUDYSITUATIONDEVELOPMENTTENDENCYWITHTHEPLANTBIOREACTORPRODUCINGMEDICALPROTEINANDTHEBASICMETHODANDAPPLICATIONRESEARCHHOMEANDABROADALTHOUGHTHEREAREALOTOFFACTSTHATLIMITEDTHEPLANTSACTINGASBIOREACTOROFTHEMEDICALPROTEINTHEADVANTAGESANDDISADVANTAGESCOEXISTATPRESENTITISANEWDEVELOPMENTTENDENCYINUSINGTRANSGENICPLANTSTOPRODUCEMEDICALPROTEININPLANTGENEENGINEERINGSTUDYKEYWORDSPLANTBIOREACTORTRANSGENICPLANTSMEDICALPROTEIN引言动物作为最早的生物反应器生产重组蛋白质曾获数十亿美元产值有着表达产物能充分修饰且具有稳定的生物活性产品成本低可以大规模生产产品质量高易提纯等等优点对于要表达不同的药用蛋白也有众多的方法如啮齿类转基因动物生物反应器动物血液生物反应器动物乳腺生物反应器等等但也有一些如转基因动物的研究存在理论基础薄弱和技术不完善家畜乳腺对外源基因的表达具有乳腺特异性转基因表达产物产品的分离与纯化难度大等等的问题的存在这些导致生产成本增加科学家们在努力寻找新的表达系统而采用转基因植物作为生产重组蛋白质的生物反应器就是一个新兴的研究领域随着植物组织培养和转基因技术的不断发展建立在植物组织培养和转基因技术上的植物生物反应器研究也有着长远的进步国外在利用转基因植物表达的方法已成功地生产了一些具有较高药用价值的蛋白多肽包括人的细胞因子CF表皮生长因子EGF促红细胞生成素EPO干扰素INF生长激素GH单克隆抗体MAB和可作为疫苗用的抗原蛋白等1植物生物反应器生产药用蛋白有两种方法建立整合药用蛋白基因的稳定表达植株2建立瞬时表达植株3稳定的整合表达系统即用遗传转化的方法将外源基因导入植物细胞并稳定地整合在植物核基因组上4用于遗传转化的方法很多目前转基因植物生产药用蛋白研究中用得较多的是农杆菌介导转化法该方法是植物基因工程中应用最多效果最理想的方法其优点是1简单易于操作且转化率高2转化的外源基因以单拷贝为多数遗传稳定性好3整合到植物基因组中的TDNA及插入期间的外源基因不仅能在植物细胞中表达而且可根据人们的需要连接不同的启动子使外源基因能够在再生植株的各种组织器官中特异性表达5这是一种用附有重组基因的微粒轰击而将目的基因导入植物细胞的方法谷类植物如水稻小麦玉米以及大豆和其他豆类6植物都可应用该方法质体的转基因一定要用基因枪导入法因为农杆菌侵染法的转移DNATDNA是定位到染色体上的故农杆菌侵染不能用于叶绿体的转基因78COM转化法此外在遗传转化途径上近年来又发展出叶绿体转化的方法1988年BOYNTON等9首次成功地用野生型的叶绿体DNA转化了单细胞生物衣藻的突变体证明植物叶绿体基因组是可以转化的随后STAUB等10报道了在转基因烟草叶绿体中高效表达具有生物活性的人生长激素表达量超过了7TSP总可溶性蛋白比其核基因组表达高出了300倍2001年RUF11将外源基因转到番茄叶绿体中在果实中得到了较高的外源蛋白为在果实中生产可口服的疫苗抗体等开辟了道路以上研究结果表明外源基因可以在叶绿体中得到稳定表达虽然目前已有多种植物被用来作为生物反应器稳定表达外源蛋白但仍有较多的植物很难进行遗传转化同时这种瓶颈问题也影响分子农业作物品种的选择植物品种不同遗传转化所耗时间不同而且不同品种作物生产外源蛋白所需的费用和能提供的价值等方面也都不相同我们可以从各方面均衡考虑从中选出分子农业的最佳经济作物如表112表1用于分子农业的几种主要农作物的比较暂态表达系统即以植物病毒如烟草花叶病毒等作为表达载体转染植物细胞植物病毒表达外源蛋白有两种方式1通过病毒基因组启动子控制外源基因的转录2将外源基因和病毒中的衣壳蛋白基因融合后包装进入病毒然后人工播种植物病毒在植物体内能自我复制这种重组蛋白能在病毒衣壳中高效融合表达目前主要采用第二种表达方式生产药用蛋白与稳定整合表达系统相比植物病毒表达载体具有不少优势1病毒增殖速度快利用嵌合病毒感染植物在短时间内就能获得高产量的外源蛋白这是整合表达系统难以办到的2植物病毒基因组很小易于遗传操作3植物病毒可以侵染单子叶等农杆菌的非寄主植物扩大了基因工程的使用范围另外植物病毒主要是利用植物细胞的遗传物质进行繁殖可以使伴随表达的外源蛋白进行真核生物特有的修饰如翻译后加工和糖基化因此这种转化方式是一条很有吸引力的途径131真空渗透法真空渗透法最早是由JYOTIKAPILA等人于1997年发展完善的此方法所的实验材料主要是离体的植物叶片由于此方法是瞬时表达外源蛋白实验周期短操作简单因此得到了快速发展2浸泡法和摩擦接种法最初的植物病毒表达系统多是将插入了外源基因的植物病毒载体CDNA进行体外转录再对转录生成的RNA进行必要的修饰然后将实验材料叶片浸泡在RNA转录产物中或者将植物病毒RNA涂抹或喷洒于擦伤的叶片表面完成侵染过程但是浸泡法和摩擦接种法对实验人员和实验环境的要求比较高而且方法昂贵繁琐3农杆菌叶片注射法正是由于摩擦接种法不易操作TURPEN等人于1993年最先将农杆菌接种法引入植物病毒表达载体对植物进行侵染它们设计了TMV的CDNA导入农杆菌中将含有外源基因的植物病毒CDNA插入TDNA左右边界间构建成双元载体通过TDNA进入植物细胞后的瞬时转录合成病毒RNA从而完成侵染此方法避免了体外转录过程降低了实验成本在此基础上发展起来的一种农杆菌接种法是叶片注射法目前叶片注射法虽然被用来表达多种蛋白但是在实验过程中要求植物必须具有几片完全展开的叶片注射法仍然需要逐个叶片进行操作而且很多植物的叶片并不适合注射法因此该方法也受到一定的限制4农杆菌真空侵染法相对叶片注射法而言真空侵染法是通过真空压力将病毒带到植物细胞中一般的真空侵染法用来处理离体的植物叶片因此扩大了宿主材料的范围但真空侵染法主要工作对象是离体植物叶片因此不能发挥病毒系统性侵染的优势根部吸收法主要是靠植物的蒸腾拉力来完成对农杆菌的吸收此过程不用处理离体叶片而是把植物的根部浸在含有病毒载体的农杆菌菌液中在实验过程中要不断地补充菌液而且要采取相应的措施避免宿主植物萎蔫COM141516表2利用植物瞬时表达体系表达的外源蛋白外源蛋白摩擦接种法HIVI抗原口蹄疫病毒抗原HIVITAT蛋白等摩擦接种法粒子轰击植物抗病毒蛋白MAP302002植物抗肿瘤蛋白GAP31等农杆菌真空侵染法人干扰素2007天花病毒单克隆抗体等农杆菌叶片注射法人酸性成纤维细胞生长因子人乳铁传递蛋白N叶绿色荧光蛋白GFP等农杆菌真空渗透法癌特异单链抗体SCFV等2植物生物反应器生产药用蛋白的优点21比较廉价植物可以在田间种植相对于动物生物反应器能昂贵的培养基减少了很多的成本植物能够进行光合作用容易大规模生产成本低廉用植物生产口服疫苗可大大减少下游加工成本且产物可贮藏在块根块茎种子或果实中便于贮运和加工另外转基因植物生物反应器的产物的生化特性和生物活性与天然产物基本完全相同减少对下游产物加工和分离纯化的费用目前常用于动物转基因的技术是胚胎微注射其转化率低规模有限成本高但是目前已成功获得的转基因植物非常多如水稻小麦玉米马铃薯棉花番茄等许多不同的技术可用于转化植物如根癌农杆菌介导法原生质体的化学刺激显微注射电穿孔和基因枪法等许多不同的植物已建立起了稳定的转化体系大多数作物种类可进行常规转化在克隆技术方面转基因动物的克隆还处于起步阶段然而植物的克隆技术如组织培养器官培养细胞培养等已相当成熟另外外源基因在植物后代中纯合快且稳定性高如植酸酶基因转入油菜后其表达可以稳定遗传的种子仍含有最初的植酸酶表达水平17相比之下细菌等微生物对外源蛋白的表达和组装能力较低即使用表达能力较强的大肠杆菌欲表达双链结构的重组抗体分子也必须借助于十分复杂的基因工程技术才能完成尚未有重组多聚体蛋白质在细菌表达系统成功表达的报道18植物不是人类和动物的致病病原体的宿主使其合成的药用蛋白不含致病病毒和微生物使其比其他生物反应器生产的药用蛋白更加的安全可靠基于上这些优点在上个世界90年代利用植物生物反应器生产药用蛋白的研究有了迅猛的发展31外源蛋白表达水平低早期的研究报道中抗原在植物中表达量大多数仅占总可溶性蛋白TSP的000103外源基因在植物中的表达量低难以累加到足够量而达到商业化生产剂量为了提高抗原的表达量使植物疫苗达到有效的免疫作用众多研究人员就如何使目的基因能高效表达展开了许多研究工作并取得了一定的成果外源目的基因在植物中的有效表达在很大程度上依赖于构建适宜于植物转化的表达盒随着分子生物学细胞生物学的发展提高药用蛋白基因的表达水平已有很多可行的方法如选择组织特异性表达的启动子或诱导型启动子或强启动子选择合适的病毒载体和表达系统通过定点突变技术优化目标抗原优化选择的密码子MRNA不稳定序列的去除整合非依赖性的表达或通过协同表达二硫键异构酶或伴侣蛋白促进蛋白质的正确表达等办法来解决表达量的问题另外提高组织特异性转录提高转录的稳定性水平和亚细胞水平的积累以提高表达量19现有许多方法来优化重组基因的结构使其更适合在特定的植物中表达2032尽管植物生产体系具有许多优点植物生产上游成本也比其它系统低但如果产物需提纯时其费用昂贵因此有待降低下游生产成本尽可能避免或部分避免表达产物的纯化如用转基因植物生产口服疫苗有时通过被修饰植物的直接消化运输生物药物产物可能不需要纯化这种生物药物及可食用疫苗能以种子块茎或果实的形式储存和分配这样就使免疫程序便宜而大大简化了管理有些不够使用而非常昂贵的生物药物如葡糖脑苷酯酶通过转基因植物生产就变得相当丰富和便宜也可将植物种子油脂体作为蛋白或肽类的载体外源基因以融合蛋白的形式表达油脂蛋白具有亲脂性使其成为高效的多肽纯化系统21另外应对传统的加工技术和方法加以改进和完善22为避免植物高尔基体中特异的糖基化过程研究发现在表达蛋白质后面添加KDEL序列可将蛋白质定位在内质网中形成对人无免疫应答的蛋白质同时还可提高蛋白质表达量23转基因产品的安全性仍存在争议尤其在口服疫苗方面如在转基因研究中用于筛选阳性克隆使用的选择标记基因多数为抗生素抗性基因人们就会担心人食用这种转基因作物后也会产生抗生素抗性另外转基因植物具有潜在的破坏生态环境的危险性公众对转基因产品接受和认可的程度还不够从而使转基因产品的市场化进程受到影响因此应加大宣传力度同时制定相应的安全和管理法规并作好安全性评估尽管转基因植物生物反应器仍存在一些问题但其易于转化并能提供廉价的蛋白质源更重要的是利用植物表达系统已成功地表达了多种外源基因产物并对其进行了理化特性和生物活性分析在动物试验和人体试验方面也已取得了重要进展相信分子生物学植物学等多方面专家学者的共同努力植物生物反应器真正成为一条安全可靠低成本途径服务人类参考文献1高书颖郭蔼光金伟波利用转基因植物生产药用蛋白研究进展J西北植物学报2003236104410482RAINERFJORGERDTOWARDSMOLECULARFARMINGINTHEFUTUREMOVINGFROMDIAGNOSTICPROTEINANDANTIBODYPRODUCTIONINMICROBESTOPLANTSJBIOTECHNOLAPPLBIOCHEM1999301011083RAINERFCARMENVMTOWARDSMOLECULARFARMINGINTHEFUTURETRANSIENTPROTEINEXPRESSIONINPLANTSJBIOTECCOMHEM1999301131164FULLNERKJLARAJCNESTEREWPILUSASSEMBLYBYGROBACTERIUMTDNATRANSFERGENESJSCIENCE1996273110711095王关林方宏筠植物基因工程原理与技术M第1版北京科学出版社19982336CHRISTOUP1996TRANSFORMATIONTECHNOLOGYTRENDSINPLANTSCIENCE1124234317COM生产重组药用蛋白的研究现状J生物学教学20053089118李漠植物生物反应器生产药用蛋白研究概述J农业科学科技资讯201091339B