细胞在微载体上迁移过程中整合蛋白a2亚基和a3亚基的表达

第二届全国发酵工程学术讨论会论文粜1998细胞在微载体上迁移过程中整合蛋白A2亚基和Q3亚基的表达顾铭欧阳藩戚艺华中国科学院生化工程国家重点实验室北京LOOOSO温华杰丹麦AARHUS大学细胞生物学系摘要本文研究VERO细胞在徽载体上迁移过程中，整合蛋白A2亚基和证3亚基的表达，以便进一步研究VERO细胞与细胞外基质的粘附。从而了解VERO细胞在微载体上的迁移机制和生长过程。结果表明VERO细胞表达整合蛋白鼠2亚基并随培养时间丽表达量增加且主要分布予细胞附着斑；VERO细胞在迁移过程中A3亚基表达增强关缝词整合蛋白，细胞迁移，微载体细胞在微载体上表现出典型的兰维立体条件下的迁移运动，与细胞在生物体内的迁移相似。所以，了解细胞在微载体上的迁移机理对认识细施在体内的迁移有非常重要的意义。整合蛋白INTEGRIN是细胞膜上一类十分重要的受体分子。整合蛋白介导细胞与细胞外基质EXTRACELLULARMAUIX相互作用，从而调节细胞极性和运动LJ“。L材料和方法1I细胞系和培养方法VETO细胞来自卫生部北京生物制品研究所。2X105ML的VETO细胞接种到15ML含O159CYTODEXI和10D、牛血清的199培养萋中培养。细膀传代方法同文献F3】。12细胞裂解方法微载体上的细胞用冷PBS洗涤两次，在裂解液1TFITONX100，025BSA，L50MMNACL，5MMEDTA，20TTGMLLEUPEPIN,20MLVITRISHEL。PH80中，4。C处理2H，1000XG离心5MIN去掉微载体，200，000XG离心，40CLH，收集沉淀，溶于常规LAEMMLI电泳载样液中。13WESTCM印迹法常规SDS世AGE电泳完毕后。100V恒压电转6080RAIN，将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中转移到硝酸纤维素膜上。兔抗弟二瑶仝目发群工程学术讨论会论文嶷1998INTEGRINA3标记硝酸纤维索膜40CD夜，然后用羊抗兔HRP标记6070MIN，用ECL化学发光试刷盒捡测。对整合蛋自以皿基的标记也依此法。14间接免疫荧光标记向双碟内的载玻片上接种VETO细胞并培养过夜，取出载玻片并用37。CPBS冲净，加35戊二醛固定3RAIN；用5牛妞清白蛋白的PBS封闭1H；冲净后。在载玻片上加满ANTIHUMANDCI作浓度为1500，放入37。C湿盒LH；冲净后，加ANTIMOUSEGOFITC，放37。C湿盒1H，冲净，控千。2结果21VETO细胞表达整合蛋白A3亚基通过蛋白质印迹法可以检测到VETO细胞在微载体上正常培养条件下表达整合蛋白O3亚基图1。一曩日J二0，M、图L用蛋白质印迹法捡测到图2间接免疫荧光标记表明A2亚VETO细胞表达整台蛋白娃甄基基主要集中在细胞的附著斑上氆细胞裂解后SDSPAGE结果B通FIG2FLUORESCENCEMICROSCOPYSHOW过ECL可见亚鏊表达A为ECL阴THEDISTRIBUTIONOFINTEGRINA2性对照ISMAINLYINADHESIONPLAQUESOFFIGITHEEXPRESSIONOF鹋SUBUNITINVETOCELLVEROCELLASDSPAGEOFCELLLYSISSAMPLEB霄ESTERNBLOTWITHICLINDICATEDTHEEXPRESSIONOFA3SUBUNITINVETOCELLCCONTROLOFWESTERNBLOTWITHECL顾龆等细胞在微载体上迁F过程巾楚台蛋白Q2亚基和D3亚基的表述2瓠OAA297LTD嚣一68KDA一A8C图3用蛋白质印迹法检测到VETO细胞表达整合蛋白砣亚基A撤戴体上培养48H后的VETO细胞表达整合蛋白以亚基B含20ILGML屡帖连聋自、LO划、牛血清的199培养液中培井48H后。蛋白质印违法检洲到VCRO细胞大量表达蹙台蛋白A2亚基；C含1纠、牛血清的199培养液中培养10D后VETO细胞整台强自A2亚基裹达量聃显高于培莽初期FIG3RE,SUITOFWESTEMBLOTINDLCETEDTHEEXPRESSIONOFINTE鲥NO2SUBUNITINVETOC4Z九THEEXPRESSIONOFINTE蜊NA2SUBONITINVEFOCELLONMICROCAXRICRAFTER48HOURSINMEDIUMT99；BTHECXPRESSIONOFINTEGRIN以SEBENITINVETOCELLWASINCREASEDAFTER48HOURSCULTUREINMEDIUM199NT曲血蟾20懈枷LEMITTIN；CTHEEXPRESSIONOFJN蛔咖NO2SBUNITINV肿CELLW怔INCREASED撕10DAYSCULTLIREINMEDIUM19922VETO细胞表达整合蛋白O2亚基间接荧光标记后可观察到以亚基主要集中在细胞的“附着斑”ADHESIONPLAQUE图2。同样地，通过蛋白质印迹法可以检测到正常培养条件下在微载体上培养48H。VERO细胞表达整合蛋白啦亚基，培养10D后，整合蛋白眈亚基表达量明显高于培养初期图3。3讨论许多细胞通过细胞膜上的一类受体分子INTE蜊N来接受外界信息。如细胞外基质的信号【4舶L。VETO细胞来源于非洲绿猴肾上皮细胞，所以与细胞外基质作用非常密切。而微载体所提供的三维立体的培养条件又与细胞在体内生长、迁移的条件相似。因此，研究微载体上细胞与细胞外基质的作用是在体外研究体内类似过程的很好的模型。本文研究表明VETO细胞在微载体上迁移时表达整合蛋自第二届全国发酵工捍拳术讨沦会论文集1998眈亚基和O【3亚基。同时，我们观察到以亚基和亚基与不同的细胞外基质结合，并可由此提示不同细胞外基质可通过不同整合蛋白调节细胞行为。这将在以后的文章中报道。参考文献【L】AUMAILLEY,M，RTIMPLE，ASONNENBERGEXPCELLRES，1990，188，55【21LUBACHDSNISSEN，SMARGHESCU,JDERMAT01SCI，1992，4，63【3】温华杰，李辉。中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4“421425【4JHYNES，RO，INTEGRNSVERSATILITY，MODULATION。ANDSIGNALINGINCELLADHESION,CELL。1992；691LT5】SHINGOM，SKAKIYAMA,ANDKMYAMADA,SYNERGISTICROLESFORRECEPTOROCCUPANCYANDAGGREGATIONININTEGRINTRANSMEMBRANEFUNCTIONSCIENCE1995；267883【61KOMBERG,LJ，HSEATP，CETURNER,ERA1，SIGNATRANSDUCTIONBYINTEGRINSINCREASEDPROTEINTYROSINEPHOSPHORYLATIONCAUSEDBYCLUSTERINGOF艮INTEGRINSPROCNATLACADSELUSA，199I；888392EXPRESSL0NOFINTEGRINA2ANDINTEGRINQ3INCELLMIGRATIONONMICROCARRIERGUMINGOUYANGFANQIYIHUASTATEKEYLABORATORYOFBIOCHEMICALENGINEERING，CHINESEACADEMYOFSCIENCESWENHUAJIEDEPTCELLBIOLOGY。LNSTANATOML，UNIVERSITYOFAARHUSABSTRACTITISNECESSARYTOSTUDYTHEMECHANISMOFCELLMIGRATION011MICMCARRIERFORTHEPURPOSEOFUNDERSTANDINGTHESAMEBEHAVIOROFCELLINANIMALBODYTHEINTEGRIN，ANIMPORTANTFAMILYOFRECEPTORSOFCELLULARADHESIVEMOLECULES。ISPRESUMEDTOHEINVOLVEDINCELLMIGRATIONONMICROCARRIEROURRECENTRESEARCHROVEALEDMATINTEGRINA2ANDWOREEXPRESSEDINVOROCELLSCULTUREDONMICMCARRIERTHEEXPRESSIONOFA2ANDA3SUBUNITSWERESTRONGLYINCREASEDWITHTHECULTURET