notch信号通路在糖尿病肾病足细胞损伤中的研究论文（可编辑）

NOTCH信号通路在糖尿病肾病足细胞损伤中的研究论文河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师或指导小组的指导下,由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果,其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文,第一署名单位为河北医科大学,试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则,承担相应的法律责任。二级学院领导盖章,、研究生签名匀戋导师签年月日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了文中特别加以标注等内容外,文中不包含其他人已发表或撰写的研究成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自负。、导师签章研究生签名匀乞车目录中文摘要英文摘要英文缩写研究论文信号通路在糖尿病肾病足细胞损伤中的研究引言第一部分信号通路在糖尿病肾病患者肾组织中的表达及意义前言刚舌材料与方法结果附图附表讨论小结参考文献第二部分信号通路在糖尿病小鼠肾组织中的表达及意义前言月舌材料与方法结果附图附表讨论小结参考文献第三部分信号通路在体外高糖培养足细胞中的表达及意义前言日吾材料与方法结果附图讨论小结参考文献结论综述信号通路的研究进展致谢个人简历中文摘要信号通路在糖尿病肾病足细胞损伤中的研究摘要目的糖尿病肾病,是糖尿病的常见并发症,是引起终末期慢性肾功能衰竭的主要原因之一。的发病机制非常复杂,糖脂代谢紊乱、血流动力学改变、氧化应激反应及多种细胞因子等是其主要起始因素。在这些起始因素的下游,又有多条信号传导通路在其中发挥着重要作用。近年来发现信号通路在的发生、发展过程中起着重要作用。已有研究表明,通路决定胚胎发育、细胞增殖和分化,在胚胎后肾形成过程中对足细胞和肾小管的分化中起着重要的作用。近年来在肾脏疾病领域的研究证实,信号通路与糖尿病肾病、局灶节段性肾小球硬化、肾病综合症等多种肾小球疾病有关,参与肾小球硬化的发生。在哺乳动物体内信号通路有四种受体和五种配体,其中受体为,配体分别为、样配体、和。配体与受体的结合导致受体构象发生改变,随后在丫分泌酶的介导下发生蛋白水解作用,释放出胞内域,转移至细胞核内,活化和等分化拮抗基因的转录,阻碍分化效应基因的表达,影响细胞的分化、增殖和凋亡。既往研究认为,的主要病理特征是肾小球基底膜。增厚、细胞外基质,堆积、肾小球硬化、肾小管萎缩及肾间质纤维化。近年研究发现,足细胞损伤在发生、发展过程中起重要作用。足细胞是终末分化的肾小球上皮细胞,它附着在外侧,是肾小球滤过膜的重要组成部分。由于足细胞是高度分化细胞,增殖能力较差,当足细胞受到损伤时,和等足细胞相关蛋白在足细胞裂孔膜,丢失,使肾小球滤过电荷屏障减弱,促进蛋白尿的发生。足盂蛋白,是足突项膜区主要的带负电荷跨膜蛋白,当足细胞损伤后表达减少,破坏了足突间的排斥作用使之发生粘附、融合,导致足细胞易于中文摘要脱落。现已知主要的凋亡通路有、心等,在发生时,足细胞内的这些凋亡通路可被激活,诱导足细胞凋亡。同时受损的足细胞对生成的调节作用发生紊乱,转化生长因子,等促进基质生成的因素增加,造成型胶原等基膜样基质增加,导致肾小球硬化,加速的进展。许多学者通过不同方法证实了信号通路在足细胞分化中的作,抑制小鼠用,等使用,分泌酶抑制剂丫后肾形成过程中通路的活化,发现近端小管细胞和肾小球中足细胞的形成明显减少,而伴随非上皮细胞的增多。如果在足细胞发育过程中出现异常通路的活化,可抑制足细胞的终末分化,引起小鼠肾小球硬化。我们通过收集临床糖尿病肾病标本、建立糖尿病小鼠模型及足细胞高糖,培养,检测信号通路家族成员、及的表达情况,并通过应用血管紧张素受体阻断剂,、基因干扰技术及信号通路抑制剂抑制通路,来观察是否信号通路参与时的足细胞损伤,促进足细胞凋亡和细胞外基质沉积,为糖尿病肾病的治疗提供一条新的思路。方法糖尿病肾病患者肾组织中信号通路检测收集年月年月在河北医科大学第三医院经病史、临床检查及肾穿刺活检病理诊断为糖尿病肾病患者例,既往无其它肾脏病史,以例肾肿瘤患者远离肿瘤的瘤旁组织做为对照组。留取血和尿标本检测血糖、糖化血红蛋白、小时尿蛋白定量切、肌酐、估算肾小球滤过率采用免疫组织化学检测、及蛋白表达。信号通路在糖尿病小鼠肾组织中的作用雄性小鼠随机分为组对照组、糖尿病组、糖尿病缬沙坦组。糖尿病模型小鼠腹腔单次注射链脲佐菌素,/,对照组只注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液,小时后测定血糖和尿糖,中文摘要血糖值/,尿糖值卅卅者确定为糖尿病模型成功。糖尿病缬沙坦组小鼠在糖尿病模型建立后,以缬沙坦/灌胃,对照组和糖尿病组以等体积蒸馏水灌胃。分别于成模后、周每组取只小鼠,收集血液及小时尿液,用于生化指标检测,方法检测尿液的含量切取肾脏中性甲醛固定用于组织化学、及免疫组织化学染色取部分肾皮质组织置于戊二醛用于电镜观察部分肾皮质组织用于提取蛋白及,检测、及蛋白表达,表达检测、及另取部分肾皮质组织于酒精固定,用于流式细胞术检测细胞凋亡率。高糖对小鼠足细胞信号通路的作用小鼠足细胞在,培养箱中,以含有胎牛血清及/的培养液培养细胞使其增殖,传代后更干扰素培养箱换为不含干扰素的冲培养液,置入,中培养天,促进细胞分化成熟。将实验细胞分成组正常糖对照/组/,、正常糖高渗对照组/,、高糖组,、/高糖阴性质粒组,、高糖/、高糖质粒组,/质粒组,、高糖组/,。分别经细胞同步化、/分组干预刺激、小时后收集细胞,免疫细胞化学检测检测、和蛋白表达、一、检测、及及蛋白表达表达和/染色检测足细胞凋亡率。结果糖尿病肾病患者临床病理表现及信号通路检测光镜下观察,对照组肾小球、肾小管及肾间质未见明显异常糖尿病肾病组肾小球体积增大,基底膜弥漫或不规则增厚,细胞外基质增多,结节形成,部分肾小管上皮细胞出现空泡变性,间质纤维化。糖中文摘要尿病肾病组空腹血糖、糖化血红蛋白、尿蛋白量、肌酐较对照组均明显增多,而肾小球滤过率糖尿病肾病组患者比对照组下降。免疫组化显示、及在肾小球及肾小管均有表达,糖尿病肾病组较对照组表达增多。糖尿病小鼠肾组织信号通路的表达及缬沙坦对信号通路和足细胞损伤的影响光镜及电镜下观察,糖尿病组小鼠轻微肾小球体积增大,系膜基质增多,基底膜不规则增厚,足细胞数量减少,足突融合,部分肾小管上皮细胞出现空泡变性。与对照组相比,糖尿病组小鼠尿蛋白从周开始明显升高,随病程延长呈逐渐升高的趋势糖尿病小鼠血糖、尿素氮、肌酐比对照组小鼠增加,随病程延长呈逐渐升高的趋势与对照组相比,糖尿病组小鼠尿蛋白和尿含量明显升高,给予缬沙坦治疗后尿蛋白和含量降低。免疫组化结果显示、和在对照组肾小球及肾小管有少量表达,在糖尿病组表达明显增加检测显示,与对照组比较,糖尿病组小鼠。肾组织中、及从周时开始升高,表达最高点在周,周时略有下降蛋白在糖尿病组比对照组表达增加,在糖尿病组各周次间表达无明显差异糖尿病组水平与对照组相比表达增加,最、和高点在周,随后下降。和显示,糖尿病组小鼠肾小球组织、和蛋白及、水平与对照组相比增加,给予缬沙坦治疗后、和降低。染色显示在糖尿病组小鼠肾组织中观察到凋亡细胞、及蛋白在糖尿病组小鼠肾小球组织中表达比对照组增加,给予缬沙坦治疗后降低蛋白表达水平糖尿病组较对照组降低,给予缬沙坦后表达升高蛋白在各组间表达无明显差异流式细胞术显示糖尿病组小鼠肾小球内细胞凋亡增加,糖尿病缬沙坦组降低,但仍高于对照组。足细胞体外高糖培养对信号通路表达及足细胞损伤的影响免疫细胞化学显示,、和在正常糖对照组足细胞中有少量表达,给予高糖刺激后表达量明显增加中文摘要检测显示,和蛋白在高糖刺激足细胞小时升高,小时表达最高,小时略有下降蛋白在高糖刺激后其它时间点的表达量是高糖刺激小时表达量的倍,高糖刺激小时足细胞中蛋白水平表达无明显差异蛋白在高糖刺激小时升高,小时达到项点,小时有所降低表达在高糖刺激和小时升高,然后随着刺激时间延长表达下降高糖刺激呈时间依赖性引起、和升高,最高峰在小时最高点在高糖刺激小时,随后随着刺激时间延长而下降。和检测发现,高糖刺激引起、表达、蛋白及、增加,和转染足细胞后表达下降,可抑制足细在高糖刺激后的过表胞、蛋白及、达现象,但、蛋白及在高糖组和高糖组之间无明显差异。检测发现高糖呈时间依赖性刺激蛋白表达,小时开始增加,小时达到最高点,而蛋白在高糖刺激后表达逐渐下降,最低点在小时在高糖刺激小时开始增加,小时为最高点,之后逐渐减少蛋白在高糖刺激下表达逐渐增加,最高点在小时蛋白在高糖刺激各时间点之间表达无明显差异。足细胞高糖培养并应用或、质粒转染后发现、及蛋白较高糖组表达下降,但较正常糖对照组表达仍高,而蛋白较高糖组表达增强,但较正常糖对照组表达仍低,蛋自在各组间表达无明显差异。荧光染色及/染色显示高糖组较正常糖对照组细胞凋亡率升高,转染组及高糖组细胞凋亡率比高糖组降低。结论在糖尿病肾病患者肾组织、糖尿病小鼠肾组织、高糖培养足细胞中发现信号通路成员有过表达现象,提示通路在糖尿病肾病足细胞中激活并可能参与足细胞损伤过程。缬沙坦抑制糖尿病小鼠肾组织中信号通路的活化,同时抑制蛋白尿和足细胞脱落,抑制凋亡相关蛋白表达,减少细胞凋亡,抑制肾小球内细胞外基质沉积。提示缬沙坦可通过抑制信号通路来产生对糖中文摘要尿病肾病的治疗效果。在高糖培养的足细胞中,应用信号通路干扰质粒及抑制剂抑制信号通路的活化后,可抑制凋亡相关蛋白表达,减少足细胞凋亡。提示信号通路参与高糖诱导的足细胞损伤。关键词糖尿病肾病信号通路足细胞损伤细胞外基质沉积凋亡英文摘要,一/,英文摘要一一,一,一,蜘英文摘要,。一,/十,/,一,。英文摘要,/,/,/,田,曲/,曲/,/,/,/,。,一,一,/,英文摘要,。,英文摘要,一,一,一,英文摘要,。,曲曲一,一曲,一,一,/,英文摘要,曲,了英文缩写一英文缩写中文译名英文缩写英文全称血管紧张索脱嘌呤/脱嘧啶核苷内/切核酸酶型受体血管紧张素血管紧张素受体阻断剂糖尿病肾病细胞外基质局灶性节段性肾小球硬化症肾小球基底膜分泌酶抑制剂高糖正常糖胞内域嘌呤霉素氨基核苷足盂蛋白肾素一血管紧张素系统裂孔膜链脲佐菌素转化生长因子血管内皮生长因子研究论文信号通路在糖尿病肾病足细胞损伤中的研究引言信号通路是一种在进化过程中相对保守的广泛存在于细胞间的信号传导通路,在细胞的增生和分化中起到了关键性的作用。信号通路最早是在对果蝇的研究中发现的,部分通路功能缺陷后,果蝇翅膀边缘会出现刻痕,因而得名。通路可影响果蝇翅膀、刚毛、眼、神经系统的形成。在哺乳动物体为信号通路有四种受体和五种配体,其中受体为,配体分别为、样配体、和。信号由受体与配体相互作用而激活。配体诱导受体发生构象改变,先在细胞外金属蛋白酶的作用下发生水解,随后又在分泌酶的介导下释放出胞内域,。是信号的活化形式,其进入细胞核后激活通路下游基因和,影响细胞分化、增殖和凋亡。已有研究表明信号通路在肾脏发育、形成过程中起到了关键性作用。和出现在“”形小体中,也可出现在集合管。表达在“”形小体的远侧部分。、和主要被检测在内皮细胞中表达。和在肾小囊的发生过程中出现在血管内皮细胞和“”形小体的近侧部分。在肾脏发育过程中没有表达。,抑制小鼠后肾形成过等使用丫分泌酶抑制剂丫程中的活化,发现上皮细胞形成明显缺陷,近端小管细胞和肾小球在足细胞发育过程中中足细胞的形成明显减少,伴随非上皮细胞增多。出现异常通路的活化,可引起小鼠肾小球硬化,抑制足细胞的终末分化。这些研究提示信号通路在足细胞和近端小管的分化中起着重要的作用。最近信号通路在肾脏中的研究,已经从肾脏的发育转到肾小球疾病中。信号通路可能在足细胞凋亡过程中起到了关键性作用。临床与实验研究发现足细胞损伤是肾小球疾病发展的重要因素,可引起严重的蛋白尿。最近根据足细胞损伤原因及数量进行肾小球疾病的组织病理学研究论文分类。信号通路的激活可能是足细胞病理损伤的一个常见机制,受影响足细胞的最终结局依赖于信号通路的水平。最近研究发现信号通路与局灶性节段性肾小球硬化症,、嘌呤霉素氨基核苷肾病和综合症的足细胞损伤有关。信号通路在糖尿病肾病,中的研究少见。在糖尿病肾病中信号通路水平可能与足细胞的损伤程度有关。信号通路被激活后,可能通过其靶基因、和,进一步导致足细胞损伤和肾小球硬化。足细胞发生损伤时可引起足细胞相关蛋白,女、整合素、等,在足细胞内的重新分布和表达量减少,足细胞与基底膜之间粘附性减低,导致足细胞脱落。另外,在肾小球疾病中足细胞数量减少,还由于可发生足细胞的凋亡。足细胞损伤后可激活足细胞内凋亡相关蛋白如、心,诱导足细胞凋亡。足细胞数目减少会造成滤过膜对蛋白选择通透性的丧失,发生蛋白尿,而尿蛋白的增加将诱导肾小球纤维化和肾小管萎缩,以上不可逆的间质改变和肾小球硬化最终将导致慢性肾功能衰竭。已有研究证实,肾素一血管紧张素系统,在的发生时在肾内激活,参与肾组织高灌注、高滤过的病变过程。我们通过检测糖尿病肾病患者和糖尿病小鼠肾组织及高糖培养足细胞中信号通路的表达情况,在糖尿病小鼠给予血管紧张素受体阻断剂,在体外培养足细胞中应用基因干扰技术及化学抑制剂抑错通路的活化,进一步探讨信号通路在糖尿病肾病中是否参与足细胞损伤,为糖尿病肾病的临床治疗提供新的靶点。研究论文第一部分信号通路在糖尿病肾病患者肾组织中的表达及意义上刖置糖尿病肾病,是一种常见的糖尿病并发症,现在已成为晚期肾病的常见原因。不仅严重影响患者的生活质量,还常常危及患者生命,因此探讨发病、发展机制,找到针对的有效治疗是非常有意义的。糖尿病肾病的发病机制非常复杂,糖脂代谢紊乱、血流动力学改变、氧化应激、炎性因子等是其主要起始因素。这些起始因素不仅参与的发展过程,还激活多条信号传导通路,各种信号通路相互作用,共同参与进程。近年来,信号通路在肾小球疾病中的作用得到了大家的重视,但其在中的作用机制还不清楚【。信号通路最早是在研究果蝇的发育过程中被发现的,基因的部分功能缺失可造成果蝇翅膀边缘刻痕,因而得名【。信号通路是一种在进化过程中相对保守的广泛存在于细胞间的信号传导通路,在细胞的增生和分化中起到了关键性的作用【,。在哺乳动物体内信号通路有四种受体和五种配体,其中受体为,配体分别为、样配体、和。信号通路配体与受体结合,诱导受体发生构象改变,在丫分泌酶丫的介导下释放出胞内域。是信号的活化形式,其进入细胞核后激活下游基因和,调节细胞转归,诱导细胞分化。近年来发现,信号通路可能在肾小球疾病的发生、发展中起到了重要作用,并与其它信号通路有相互作用。已有研究发现信号通路与局灶性节段性肾小球硬化症、嘌呤霉素氨基核苷,肾病和综合症的足细胞损伤、肾小球硬化有关【,。在这个部分中,我们收集临床肾穿刺标本,通过检测糖尿病肾病患者肾组织中信号通路的表达情况,为进一步研究信号通路与糖尿病肾病肾小球硬化之间的关系提供依据。研究论文材料与方法仪器石蜡切片机德国公司石蜡包埋机德国公司全自动显微照相系统日本公司病理图像分析系统北京航空航天大学透射电镜日本日立公司低速离心机上海医疗器械集团公司低温冰箱日本三洋公司电热恒温孵育箱重庆实验设备厂型医用微波炉上海中达医学研究所试剂美国公司兔抗多克隆抗体兔抗多克隆抗体美国公司兔抗多克隆抗体美国公司兔抗多克隆抗体美国公司美国公司兔抗多克隆抗体多聚赖氨酸河北博海生物公司三步法免疫组化试剂北京中杉生物技术有限公司显色试剂盒北京中杉公司进口分装试剂配制,溶于蒸馏水中。临床标本收集收集年月年月在河北医科大学第三医院肾内科住院,经病史、临床检查及肾穿刺活检病理诊断为糖尿病肾病患者例,年龄岁,其中男例,女例。所有病人未应用糖皮质激素、细胞毒药物,除外其它合并膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化、肾病等原发性肾脏病及继发性肾病如乙肝病毒相关性肾炎、狼疮性肾炎、紫癜性肾炎、淀粉样变性、骨髓瘤肾病等。研究论文以例肾脏肿瘤患者远离肿瘤的瘤旁组织做为对照组。肾组织常规石蜡包埋,切片,进行组织化学及免疫组化检测。收集隘床资料,包括性别、年龄、身高、体重、血压、家族史、病程、服药史、血糖、糖化血红蛋白、小时尿蛋白定量、肌酐、估算肾小球滤过率等。以例无糖尿病病史,肾功能正常体检者血尿标本进行检测作为正常对照。染色切片脱蜡至水,过碘酸氧化分钟,蒸馏水冲洗次,每次分钟,还原液分钟,氏液分钟,自来水洗,苏木素复染,脱水透明,中性树胶封片。免疫组织化学检测、及蛋白表达采用免疫组化法进行检测。制备肾组织石蜡切片,切片经常规脱蜡至水,甲醇溶液室温孵育分钟封闭内源性过氧化物酶,蒸馏水冲洗次,每次分钟,切片加入抗原修复液/柠檬酸,采用微波修复法进行抗原修复,连续修复两柠檬酸钠缓冲液,次,第一次修复功率为档,修复分钟,第二次修复功率为档,修复分钟,室温下冷却分钟,磷酸盐缓冲液冲洗次,每次分钟,加入正常山羊血清,分钟封闭内源性生物素,甩掉血清滴加兔抗、及多克隆抗体,孵育过夜,次日取出切片,冲洗次,每次分钟,滴加生物素标记的山羊抗兔,孵育分钟,冲洗次,每次分钟,滴加辣根酶标记链霉卵白素,孵育分钟,冲洗次,每次分钟,二氨基联苯胺显色,光镜下观察并控制显色程度,蒸馏水冲洗,苏木素复染,阳性部位呈棕黄色,脱水透明,中性树胶封片。以替代一抗作为阴性对照。运用图像分析系统邶认,同济医科大学清屏影像公司对各组切片随机选取个高倍视野,分析肾小球免疫组化阳性信号的积分光密度值,细胞核表达的计数肾小球阳性细胞核占所在肾小球总细胞核百分比。以各组阳性表达的均值作为最终结果。统计学处理应用软件分析系统进行统计学处理。计量资料用均数标研究论文准差妊峪表示,各组间数据比较采用方差分析,差异有统计学二也巴、,思义。结果肾脏形态学改变光镜下观察,对照组肾小球、肾小管及肾间质未见明显异常糖尿病肾病组肾小球体积增大,基底膜弥漫或不规则增厚,细胞外基质增多,严重者结节形成,肾小球硬化部分肾小管上皮细胞出现空泡变性,间质纤维化,小动脉管壁略增厚。生化指标检测糖尿病肾病组患者空腹血糖、糖化血红蛋白、尿蛋白量、肌酐较对照组均明显增多,而肾小球滤过率糖尿病肾病组患者比对照组下降尸,。,肾组织中通路的表达免疫组化显示对照组和在肾小球和肾小管胞浆中有少量表达,糖尿病肾病组与对照组比较表达明显增强氏,、及在肾小球和肾小管细胞核中表达,糖尿病肾病组比对照组表达增加,。研究论文附图互寸瓮吾尸研究论文圈互譬芝勺蠹口三二血堍圈暑雹屯磊器翟。荽鳞誊一。,弋,墓每,、。五,二一,“。、王工。,”、。、黟黪,。、,“,、一、,。二凄餮菇一一二尊。露薯孓、一,一一,、。、,一冀繁鹾。肇,觚岫玎蛐,撇姻兽磐莒研究论文附表,妊嗡,”研究论文讨论信号通路是调节细胞增殖和分化的重要通路,最近在肾小球疾病中的研究越来越得到大家的重视【,。有研究通过在转基因小鼠体内表达,结果发现其可通过激活途径,引起足细胞凋亡伴系膜增生,裂孔膜变大,出现蛋白尿,节段性肾小球硬化和肾间质纤维化【。,在非转基因小鼠模型中应用丫分泌酶抑制剂丫抑通路活化,可保护足细胞损伤,减少足细胞足突消失,阻止蛋白尿产生】。我们通过免疫组化检测发现在对照组肾小球中通路成员仅见少量表达,而在糖尿病肾病患者肾小球通路配体和受体表达增加,配体和受体的结合可诱导受体发牛构象改变,存分泌酶的介导下向细胞内释放出。通过观察发现及其下游基因、在糖尿病肾病患者肾小球中表达较对照组明显增强。这些说明在发生、发展过程中,肾组织中会出现通路的激活。等也发现在糖尿病肾病患者和糖尿病模型中存在、和表达增加,并与血糖及足细胞损伤程度呈正相关,使用或敲除转录因子后可阻止足细胞凋亡,延缓肾小球硬化。足细胞是终末分化的肾小球上皮细胞,它附着在肾小球基底膜外侧,是肾小球滤过膜的重要组成部分,由于足细胞是高度分化细胞,增殖能力较差【引。在糖尿病肾病中,血糖、血流动力学改变、脂质代谢紊乱、氧化应激、炎症因子等引起肾小球足细胞的损伤。我们发现在糖尿病肾病患者肾组织信号通路被激活的同时,还发现糖尿病肾病患者血糖增加,尿蛋白增加,肾脏功能下降,增厚,肾小球硬化。这些提示糖尿病。肾病患者肾组织通路的活化可能与肾小球足细胞损伤有关。受损的足细胞表现为细胞内固有结构蛋白减少,粘附性下降,可发生脱落或凋亡,造成肾小球内足细胞数量和密度减少,暴露,破坏滤过膜,产生蛋白尿【。同时,受损的足细胞引起细胞外基质,增加,进而导致肾小球硬化,造成肾脏损伤引。因此,足细胞的损伤是最终引起肾小球硬化的关键性因素。研究论文通过检澳信号通路,观察其与发展过程中肾脏损伤之间的关系及机制,将为的防治提供了一条新的途径。小结糖尿病肾病患者肾组织中出现信号通路激活。糖尿病肾病患者出现肾功能损害及肾小球硬化。参考文献,一虹,一,/,/,。,研究论文,一,/,。,研究论文第二部分信号通路在糖尿病小鼠肾组织中的表达及意义一刖昌足细胞是高度分化的肾小球脏层上皮细胞,通过帕整合素和砣。蛋白聚糖复合体连接于肾小球基底膜上,足细胞足突之间形成许多裂孔,裂孔上覆盖有裂孔膜,是维持。肾小球滤过膜的最后屏障,阻止血浆蛋白滤过,。在糖尿病肾病,中,血糖、血流动力学改变、脂质代谢紊乱、氧化应激、炎症因子等引起肾小球足细胞的损伤,这一病损可早于系膜细胞和小管细胞数年,与临床早期持续蛋白尿相关,可导致肾小球硬化【,。首先,糖尿病肾病足细胞中的足细胞相关蛋白发生结构改变、分布异常和表达量的减少。通过对糖尿病肾病患者研究表明,蛋白可以发生从足细胞膜到细胞质的重新分布和表达量减少,导致滤过膜对蛋白选择通透性的丧失,发生蛋白尿【】。足盂蛋白,是足细胞足突顶膜区主要的带负电荷跨膜蛋白,也是组成肾小球基底膜电荷屏障的主要物质,当足细胞损伤后表达减少,一方面破坏了足突间的排斥作用使之发生粘附、融合,导致足细胞易于脱落,另一方面裂隙膜完整性受到破坏,肾小球滤过电荷屏障减弱,促进蛋白尿的发生,加速进展。另外,在糖尿病肾病发生时可激活足细胞内凋亡相关蛋白如、发生凋亡。等【】在糖尿病模型及高糖培养的足细胞中发现/值和显著升高,足细胞凋亡增加。足细胞凋亡后造成足细胞数目减少会进一步加重蛋白尿,而蛋白尿的加重将引起细胞外基质,增加,诱导肾小球间质纤维化和肾小管萎缩,以上不可逆的问质改变和肾小球硬化最终将导致慢性肾功能衰竭【。因此糖尿病肾病足细胞的损伤是最终引起肾小球硬化的关键因素。已有研究证实,肾素血管紧张素系统,在的发生时在肾内激活,参与肾组织高灌注、高滤过的病变过程【。研究论文作为系统的主要效应因子,在,血管紧张素肾组织内常明显升高,通过血流动力学及非血流动力学因素,在进可以通过多种途径造成足展过程中发挥重要作用。在的早期通过与其受体结合从而发挥生物学细胞损伤,导致蛋白尿发生【引。生物学效应主要是由血管受体有四型,其效应,至今发现紧张素型受体帅,介导。缬沙坦是血管紧张素受体阻断剂,具有肾脏保护作用,是目前治疗的常规药物】引。大量研究表明,缬沙坦具有降低血压,减少蛋白尿,改善肾小球损伤及纤维化的作用。在前一部分,我们发现信号通路在糖尿病肾病患者肾小球组织中激活。在这一部分中,我们建立糖尿病小鼠模型,通过检测糖尿病小鼠肾组织中信号通路的表达情况,来研究信号通路与糖尿病肾病足细胞损伤之间的关系,并观察缬沙坦对糖尿病小鼠信号通路以及足细胞损伤的影响。材料与方法仪器血糖分析仪美国强生公司电热恒温箱重庆实验设备厂型医用微波炉上海中达医学研究所石蜡切片机德国公司石蜡包埋机德国公司台式高速冷冻离心机北京四环科学仪器厂紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司旋涡混合器上海精科实业有限公司超低温冰箱青岛自动三重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂低速大容量多管离心机上海安亭科学仪器厂恒温磁力搅拌器上海司乐仪器厂压力蒸汽火菌器博迅实业有限公司医疗设备厂研究论文垂直电泳槽北京市六一仪器厂转移电泳仪北京市六一仪器厂转移电泳槽北京市六一仪器厂水浴振荡器哈尔滨科学仪器厂凝胶成像分析仪美国公司电热恒温干燥箱天津市华北实验仪器有限公司德国公司梯度基因扩增仪实时定量仪安捷伦科技有限公司水平电泳槽北京市六一仪器厂电子恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司电子天平北京赛多利斯天平有限公司型离心机上海安亭科学仪器厂透射电镜日本日立公司电子天平重庆衡器厂光学显微镜日本型流式细胞仪美国公司试剂链脲佐菌素美国公司多聚赖氨酸河北博海生物公司美国公司兔抗多克隆抗体兔抗多克隆抗体美国公司兔抗多克隆抗体美国公司美国公司兔抗多克隆抗体美国公司兔抗多克隆抗体兔抗多克隆抗体美国公司美国公司兔抗多克隆抗体美国公司兔抗多克隆抗体鼠抗美国一单克隆抗公司体兔抗多克隆抗体美国公司北京博奥森公司兔抗多克隆抗体研究论文小鼠检测试剂盒上海蓝基生物科技有限公司组织提取试剂盒美国公司荧光检测试剂盒美国公司增强化学发光试剂盒美国公司北京中杉公司进口分装辣根酶标记羊抗兔北京中杉公司进口分装辣根酶标记羊抗小鼠预染蛋白分子量美国公司蛋白酶抑制剂美国公司膜美国公司显色试剂盒北京中杉生物技术有限公司三步法免疫组化试剂北京中杉生物技术有限公司三羟甲基氨基甲烷天津市华东试剂厂脱氧胆酸钠美国公司二硫苏糖醇美国公司苯甲磺酰氟德围公司考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒南京建成生物工程研究所十二烷基磺酸钠美国公司溴酚蓝美国公司石家庄拜昂生物公司甘氨酸美国公司美国公司丙烯酰胺美国公司亚甲双丙烯酰胺美国公司过硫酸铵美国公司匝美国公司美国公司美国公司脱氧核糖核苷三磷酸心汀赛百盛公司美国公司美国公司琼脂糖葡萄牙进口分装研究论文溴化乙锭美国公司缬沙坦北京诺华制药有限公司试剂配制/,蒸馏水中。,溶于,用浓调节,加蒸馏水值至,加水补足至。含的,即为。柠檬酸柠檬酸钠缓冲液/,液/柠檬酸蒸馏水柠檬酸溶于液/柠檬酸钠蒸馏水柠檬酸钠溶于取皿液,液,混合成终浓度为的缓/,冲液。配制溶于蚰柠檬酸柠檬酸钠缓冲液中,浓度为酬,现用现配,避光。/,取液和/柠檬酸抗原修复液。液,混合后加蒸馏水定容至电泳缓冲液甘氨酸,。蒸馏水溶解后,定容至蒸馏电转移缓冲液甘氨酸,预冷备用。水溶解,甲醇,蒸馏水定容至贮存液丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺,先用,避“蒸馏水溶解,待完全溶解至溶液透明,加水定容至光保存。/溶于蒸馏水中,用,保存。/的调值为,加水定容至/碱溶于蒸馏水中,保存。用/的调值为,加水定容至电镜固定液液双蒸水液唧研究论文双蒸水组织固定液液与液混合戊二醛。后,加入戊二醛加样缓冲液/甘油溴酚蓝糖尿病动物模型建立及分组只雄性小鼠,周购自北京维通利华公司。动物随机分为组对照组和糖尿病组。糖尿病组小鼠腹腔单次注射/,对照组只注射相当体积的枸橼酸盐缓冲液,小时后尾尖取血,血糖仪测定血糖,尿糖试纸测/,尿糖者确定为糖尿病模型。分别定尿糖,血糖于注射后周、周、周及周每组取只小鼠,分别用代谢笼收集小时尿,用于尿液和检测股动脉取血分离血清切取肾脏,取部分肾组织置于中性甲醛及戊二醛固定,用于光镜、电镜观察及免疫组化检测部分肾皮质组织经液氮速冻后保存于冰箱,用于和检测部分肾皮质用乙醇固定后用于流式细胞术检测。血尿生化指标检测全自动生化分析每个样本取血清和山尿液,采用日立仪测定血糖、尿素氮及肌酐。每个样本取山尿液用西门子全自动免疫发光分析仪检测尿蛋白浓度,计算尿蛋白量。检测尿中的含量先后加入稀释后的标准品、待测样品于反应孔内,立即加入山的牛物素标记的一抗,轻轻振荡混匀,孵育分钟。甩去孔内液体,震荡洗涤次,每次秒。每孔加入山的辣根酶标记的二抗,轻轻振荡混匀,孵育分钟。甩去孔内液体,震荡洗涤次,研究论文轻轻振荡混匀,孵育每次秒。每孔加入底物、各山,分钟,避免光照。取出酶标板,迅速加入终止液,立即测定结果