天然抑菌剂的定向筛选及其在鱼糜制品防腐保鲜中的功效评价

浙江工商大学硕士学位论文天然抑菌剂的定向筛选及其在鱼糜制品防腐保鲜中的功效评价姓名韩强申请学位级别硕士专业食品科学与工程指导教师励建荣201105天然抑菌剂的定向筛选及其在鱼糜制品防腐保鲜中的功效评价鱼糜制品因营养丰富、价格适宜、食用方便受到国内外广大消费者的青睐，已经成为我国发展最快、出口创汇最多的水产制品之一。然而，由于鱼糜制品水分含量高、营养丰富，极易滋长微生物而腐败变质。因此，寻求天然、安全、高效的抑菌剂应用于鱼糜制品的防腐保鲜，已经成为食品科学领域的一个重要研究课题。本论文针对当前鱼糜制品易腐变质、缺乏高效安全的保鲜剂这一困扰鱼糜制品加工的重要问题，以天然植物材料为研究对象，通过构建抗菌定向筛选模型，发现杨梅渣提取物具有较好的抑菌作用；进一步从微生物理化指标、鱼糜感官特性等方面评价了杨梅渣提取物对鱼糜制品的防腐保鲜效果；在此基础上，利用扫描与透射电镜技术，通过研究细菌的亚细胞显微结构探索了杨梅渣提取物的抑菌机制。主要研究结果如下变质相关菌株作为筛选模型，以桑叶、荷叶、杨梅渣等种常见植物材料的提取物为研究对象，发现杨梅渣、黄莲、桑叶提取物对假单胞菌的浙江工商大学硕士学位论文鱼糜制品的保鲜功效研究。结果表明，在鱼糜制品中添加杨梅渣乙酸乙浙江工商大学硕士学位论文坏作用，通过抑制细菌的蛋白质合成，导致细菌生长受到抑制，同时破坏细菌的细胞壁和细胞膜，增加细胞膜与细胞壁的通透性，导致大量菌体胞内内含物释放，造成菌体的死亡。综上所述，本论文的研究结果将为开发天然来源的抑菌剂、解决鱼糜制品的生物保鲜及延长鱼糜制品的货价期提供了一种思路和方法；同时也为杨梅渣的综合利用、实现杨梅加工产业的技术升级提供了一定的浙江丁商大学硕士学位论文瓸，琣琣浙江工商大学硕士学位论文，；，猙瓸甌琤珽，印猵瓵，浙江工商大学硕士学位论文，籄浙江工商大学硕十学位论文植物源提取物的抑菌研究现状农业在我国国民经济中占据重要地位，而以农产品为基础原料的食品加工的关键问题是食品的保鲜，在食品中添加防腐剂，因其简便有效而应用广泛。目前国内外实际使用的食品防腐剂仍以化学合成物如苯甲酸为主，在常规使用量下，其防腐效果并不十分理想，而且近年来，国外专家对一些合成防腐剂的安全性不断提出质疑，高，对食品安全提出更高的要求，追求添加剂的天然、营养和功能化。鉴于此，寻求安全、高效的天然食品防腐剂一直是食品科学、生物领域及中药学中的重要课题。天然食品防腐剂可来自微生物和动植物组织。目前国内外对植物源天然食品防腐剂的研在许多生理活性物质，具有抗菌、抗氧化和其它生理作用，并且符合国内外一贯提倡品防腐剂开发中还存在一些问题，但从植物中提取多功能的天然食品防腐剂的前景仍然十分广阔。近年来，国内外对植物源防腐抑菌剂的研究倍受重视，并取得了较大的进展，发活性物质主要包括萜烯类、生物碱类、黄酮类、酚类、醌类、醛类、醇类、苯丙素类、香豆素类、木脂素类、甾体、有机酸类、精油、独特的氨基酸和多糖等【】。有研究氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等致病菌具有抑菌活性，蒲公英中的槲皮素甇葡萄糖苷和槲皮素甇半乳糖苷、黄芩中的黄芩苷和甘草中的查耳酮均有抗菌活性。械种黄酮醇甙化合物黄柏甙对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌均有抑制作用，尤其对枯草杆菌的抑菌活性最强，最低抑菌质量浓度为疞。长生花中分离到的多酚对地霉、大肠杆菌和酵母等具有抑制作用。苯多酚、厚朴酚和鞣酸对变链菌、乳杆菌、粘性放线菌、坏死梭杆菌、牙龈卟啉菌具有强弱不同的抑制作用。浙江工商大学硕士学位论文黄酮类化合物却种苔藓植物中分离纯化的七种黄酮类化合物对大肠杆菌具有抑制黄酮类化合物传统提取方法有有机溶剂、热水恒温水浴刨流提取法等。乙醇和甲光度值，以芦丁为对照，表示仙人掌中总黄酮含量。浙江工商大学硕士学位论文槲皮素一彤秘山綮酚鞣质鞣质是多元酚又称为植物单宁，是一类广泛存在于植物中的复杂多元酚类化合物，具有涩味和收敛性，能使生皮成革。按照鞣质的化学结构特征将珼缩合鞣质酱罄郙。鞣质对多种细菌、真菌、酵母都有明显的抑制作用。例如纯化后的柿子鞣质可以有效地抑制破伤风杆菌、白喉苗、葡萄球菌等，丹皮、熊果、老鹳草中的水解鞣质，茶叶、槟榔中的缩合鞣质能增强抗龋齿作用，这是因为鞣质抑制了致龋齿的主要病原鞣质具有广谱的抗病毒作用。水解鞣质抗病毒活性与桔酰基和数目有关，这两种基团的数日越多，抗病毒活性越强，而分子中的多元醇与其抗病毒活性关系不大。缩合鞣质抗病毒强度则与缩合程度有关，缩合程度越人，抗病毒活性越高。鞣质对多种寄生虫有直接杀灭作用。很多鞣质对血吸虫有直接杀灭作用，含大量鞣质的石榴皮和槟榔也有杀虫作用。起直接杀寄生虫作用的是槟榔中所含长链脂肪酸，而缩合鞣质具有协同作用。帖类果，如测定抗菌剂的活性，建立最小抑菌浓度，评价抗菌谱等有一定的困难。食物抗浙江工商大学硕士学位论文菌剂活性的测定需要统一化、标准化，科研工作者不断改进他们的测定方法，旨在可以使不同实验室之间所得的实验数据有可比性，同时与活性物质的使用有密切的关系，使学术界、工业生产及相关的科研工作者都能从中受益。目前常用的方法分为体外实验法和实际应用法。体外实验法中的任何试验都是没有将化合物应用于真实的产品当中。这些方法只能对目的物潜在的实用性提供初步的信息。实际应用法是直接应用于食品当中，来观测待测物对食品中天然存在的或是接种上去的微生物的影响。体外实验法包括终点法和描述分析法。终点法是指将待测物与微生物共同培养一定的时间，来观测特定时间对应化合物的抑制作用。描述法是定期采样测定经时的有活力的细胞数目来完成的。这两种方法都可以用于抗菌剂制品的效能测定。具体实验室的抑菌试验主要有混合制成混菌平板，凝固后，在平板上等距离放入个灭菌牛津杯诰，外，高的不锈钢杯扛鼍柚个重复，一个无菌生理盐水为对照，取植物提取液加入牛津杯中，细菌、真菌培养试管连续稀释法原药液置于第攀怨苤校然旌希潭菌丝生长速率法菌丝生长速率法【从的甲醇和水混合液将供试样品稀释成浓度为疞，疞和疞的待测液，分别与灭菌的定量培养基混合后，倒入直径为的打孔器在培养好的供试菌菌落边缘切下菌饼反接于培养肌内，培养，用十字交叉法测量菌落扩展直径，并按下式计算菌丝生长抑制率。，测定植物提取液的抑菌效果，将经过记数的菌液稀释后，控杨梅介绍谥参锟艼属杨梅科、杨梅属果树，多年生常革质，倒披针形，农面深绿色有光泽，背面色稍淡，具菌根。雌雄异株。核果圆球形，耐阴，不耐强烈日照。喜排水良好的酸性土，微碱性土壤也能适应，不耐寒，深根性图杨梅浙江丁商大学硕士学位论文蜜饯等，果仁可榨油。根为收敛剂，治下痢出血，跌打损伤及烫伤等，并富含单宁，可提取拷胶用于熬制鱼网染料等，叶含有黄酮类化合物商崛枷阌含油率。杨梅果核中的黄酮类成分具有抗氧化性能目前以杨梅为材料的研究主要集中在杨梅的保鲜、杨梅产品的开发以及杨梅中花色苷的组分鉴定、色泽稳定性以及抗氧化性。而对杨梅叶的研究报道较少。杨梅味甘酸而性温，有生津止渴、和胃消食、益肾利尿及消暑诸功能。明代医学家李时珍所著的本草纲目中记载“杨梅昧酸甜，性温、无毒。能止渴、和五脏、开宝本草中记载杨梅“主去痰、止呕、断下痢，清食解酒【】蠲返囊眉壑导撸涔怠省丁扇胍。我国民间历来目前国内外关于杨梅的相关研究报道很少，对杨梅的开发利用，侧重于鲜果及果杨梅树皮、树根、树叶、果实中活性物质的提取与分离纯化，国内的相关报道较多，初步研究了杨梅叶的抗菌作用；迟文等研究了杨梅多酚对血细胞与造血组织损伤的保护作用】。有关杨梅果实中抑菌活性物质的研究，还是起步阶段，相关研究还是空白。鱼糜制品概况鱼糜制品是一种新型的水产食品，于世纪年代迅速发展。系以鱼肉为原料，将鱼肉粉碎，加食盐、副原料等进行擂渍，成粘稠的鱼肉糊再成型后加热，变成具有弹性的凝胶体，此类制品包括鱼丸、鱼糕、鱼香肠、鱼卷等。由于鱼糜制品加工原料不受鱼体大小、种类的限制，为低值鱼、小杂鱼以及水产加工下脚料的综合利用和深加工提供了出路，提升了其附加值。因此，鱼糜制品已成为日前经济意义最大、附加值最高，也是最具代表性的加工水产品，已成为多数发达国家水产品加工行业的主流，产业发展前景广阔。国的日本常用的主要原料鱼有海鳗、鲻鱼、日本马头鱼、绿鳍鱼、平鳓、牙鲆、箭鱼、多鲮鳍、缎虎鱼、长背鱼、飞鱼、蛇鲻、小黄鱼、带鱼、远东多线鱼、鲽、鲤、鲨鱼浙江工商大学硕士学位论文气调保鲜水产类动物的休眠特性，将活鱼放于溶解有乃校怪焖傩菝撸倮坛鲆迫氤溆蠧的密封容器中，保存一周，鲜度较佳。另外据报道，用不致使鱼肉变软的氨，喷雾于鱼体表面上，也可达到保鲜的目的。浙江工商大学硕士学位论文在过去的年中，许多科学家对鱼和鱼制品的气调包装进行了研究，并且有较，引，冰温储藏相对于冷藏可有效延长保鲜期，但对于水产品这类极易腐败的食品来说，保鲜期仍然较短。因此综合冰温保鲜和气调保鲜的优点，学者提出了冰温气调保鲜技术，与传统的冷藏保鲜技术比较，冰温气调保鲜技术可延长水产品加工制品的货架期倍。化学保鲜就是在食品生产和贮运过程中使用化学制品以提高食品的耐藏性和达到某种加工目的。它的主要作用就是保持或提高食品品质和延长食品保藏期。其优点在于，在食品中添加了少量的化学制品，就能在室温条件下延缓食品的腐败变质。世纪年代，国内外都曾采用各种广谱性抗生素四环素，土霉素，阿莫西林，金霉素用于水产品的保鲜，使用的方法有泼洒法、浸泡法、抗菌素冰等，均有明显的保鲜效果，后来由于在鱼虾中出现了抗菌素的残留量和细菌的耐药性问题，从而从公共卫生学的角度降低了它的应用价值。进入世纪年代，化学保鲜得到了进一步的发展，研究主要朝着天然无毒的生物活性物质方向发展。化学药物保鲜方法简便高效，若能与低温配合使用，其效果更为明显，由于国际上对食品卫生管理极为严格，因此国内外研究人员正在努力开发一些天然的无毒的保鲜剂。辐照杀菌保鲜辐照杀菌是采用放射性同位素龅，射线，或电子加速器对食品进行辐照，杀灭食品中的病原微生物及其他腐败细菌或抑制某些食品中的生物活性和生理过程，从而达到食品保藏或保鲜的目的。本课题的研究目的与意义鱼糜制品因营养丰富、价格适宜、食用方便而受到国内外广大消费者的青睐，已经成为我省发展最快、出口创汇最多的水产制品之一。然而，由于鱼糜制品水分含量较高、营养丰富，极易滋长微生物而腐败变质，同时也存在致病菌污染的风险。浙江工商大学硕士学位论文鉴于此，结合当前产业发展形势、企业实际需求及本课题组在水产品加工方面的研究优势，本研究拟从广大的植物源中提取有效的抗菌抗氧化活性物质，开发针对鱼糜制品的生物保鲜剂，使鱼糜制品延长货价期，鱼糜制品的品质特性得到改善。研究成果将为深度开发杨梅产品，重新利用杨梅渣，提升鱼糜制品保鲜贮运技术，提高产品竞争力和市场占有率，扩大出口创汇等方面提供科学储备和技术支撑，有助于杨梅浙江工商大学硕士学位论文我国劳动人民很早以前就积累了许多利用植物防腐杀菌的经验，并将其应用到实际生产中去。香辛料是应用较早的食品防腐剂，有着悠久的应用历史。中草药是天然植物抑菌物质的又一重要来源，我国药用植物种类位居世界前列。调查数据显示我国已鉴定的药用植物种类已经超过种，其中近千种植物对细菌。中国传统药用植物丁香、生姜、麻黄、板蓝根、艾叶、鱼腥草、黄柏、苦参等都是具有抑菌活性的巾草药。中药也历来就被公认为是既有益健康又有特定治疗效果的天然药物，利用具有悠久使用历史的中草药作为食品防腐剂具有低毒、易被消费者接受的优点。国内众多学者对中草药在食品中的应用进行了广泛研究，取得了丰硕成果】，发现多种中草药都具有一定抑菌作用，且抑菌范围较广，对常见的病原芮如淋病球菌、白色念球菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌以及黑曲霉、黄曲霉、口本曲霉、杂色曲霉、毛壳荫、链抱霉、橘青霉等致病性微生物都有较强的抑制作用，其中黄连的抑菌能力最强、其次是大黄、黄芩、大青叶、艾叶、鱼腥草等。目前市场上以大青叶、黄连、黄芩为原料用于治疗病毒性感冒以及各种炎症的中成药屡见不鲜。中草药中的抑菌活性物质主要包括牛物碱类、黄酮类、香豆素和内酯类、皂苷、酚类化合物、葸酮类和萜类化合物等。此外，天然植物芳香油也有抑菌功效。茴香挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、变形杆菌和大肠杆菌等有良好的抑菌效果。银杏是我国特产植物之一，银杏叶提取物对食品中常见致病菌均有一定抑制作用。宫霞等研究表明银杏叶提取物对食品中常见致病菌的最低抑菌浓度分别为金黄色葡萄球菌湫胃司，大肠杆菌莶菅勘司，产气杆菌趁攀暇，乙醇浸提、减压蒸馏等方法制备了竹叶提取物，并采用抑菌圈法以金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌和大肠杆菌为供试菌种对提取物进行了抑菌活性研究，结果表明竹叶提取液对枯草芽抱杆菌的最小抑菌浓度为，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为浙江工商大学硕士学位论文供试菌种均购自中国菌种保藏巾心，初始菌株为冻干茵粉，相应液体培养基活化芦丁上海博蕴试剂有限公司琹交趸诫耹，狣上海博蕴试剂公司；超氧自由基试剂盒南京建成生物试剂公司；铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、乙醇、高硫酸钾、邻二氮菲、硫酸亚铁、双氧水、抗坏血酸等均为国产分析纯，购自浙江省华东医药公司。旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；瓺台式恒温振荡器江苏省太仓市实验设备厂；浙江工商大学硕士学位论文微量分析天平上海精科仪器有限公司；高速万能粉碎机天津市泰斯特股份有限公司；实验方法由于它们在海产品工业中的关联性，所以选择了以下的腐败菌，菌株在适当的培芊雍康牟舛浙江工商大学硕士学位论文钟后，加入的碳酸钠水溶液并混合。焙笤谑椅孪掠型分光光处测定吸光度。提取物中总酚类化合物的浓度是由比较样品提取物的芑仆康牟舛总黄酮含量采用比色法来测定。将南脱贩湃牒衛双蒸水的试管中。接着，在、种邮狈直鹛砑，和其吸光度。各提取物中黄酮含量根据芦丁的标准曲线来计算，表示为每克杨梅渣固体中所含的芦丁。将不同浓度，闹参锾崛锛尤氲处分光光度计测定吸光度并记验重复三次。脱色程度表明了这些物质的自由基清除效率。植物提取物抑制自由基的形成的抗氧化活性计算如下并表示为值。值定义为清除率为时，所需的化合物浓度痬。在这个测试中，衾胱幼杂苫苫旌在黑暗中室温下进行。之前使用的，掖枷偷挠梅止夤舛燃圃处得到的约士的吸光度囊掖甲隹瞻锥哉。芤，的测试样品中，并充分混合。混合物在室温下放置种樱丛处测定吸光度并记录。溶剂空白对照组在每个试验和测量是的吸收下降率的计算公式如下杂苫。狾鱩。】最终以抑制时的提取液浓度作为评价提取液抗氧化效果的标准。浙江工商大学硕士学位论文图植物提取物对假单胞菌的抑制效果图植物提取物对沙雷氏菌的抑制效果食品腐败的首选方法之一。图和图中显示，从中国传统植物巾得到的乙醇粗活性较高的分别是黄连、杨梅渣、桑叶；抑制沙霄氏菌活性较高的分别是魔芋、杨梅渣、桑叶。黄连虽然对假单胞菌有较强的抑制作用，但对沙雷氏菌几乎没有抑制活性。同样，魔芋虽然对沙雷氏茼有较强的抑制作用，但对假单胞荫大的抑制活性较弱。杨浙江工商大学硕士学位论文梅渣提取物显示出了更强的整体抑制作用，综合抑菌效果、生产成本等多方面因素，确定杨梅渣提取物为候选的天然抑菌剂。相对地，很少有人知道其对食品腐败菌的生长作用也有抑制活性。我们在此之前证明了，杨梅乙醇提取物中富含多酚。这些多酚类抗氧化剂也可以用来保存食品，因由图中可以看出，在没食子酸在之间呈现良好的线性关系，图各植物提取液的总酚含量酚类化合物是一类非常重要的植物次级代谢产物，其结构以及在植物中的分布情浙江工商大学硕士学位论文图芦丁浓度标准曲线由图中可以看出，芦丁在之间呈现良好的线性关系，相关系数。黄酮化合物是一类重要并且在植物界分布很广的天然化合物。药理学试验证明，浙江工商大学硕士学位论文天然的抗氧化剂能有效的清除自由基从而保护机体健康，从植物中寻找高效、廉价、低毒的天然抗氧化剂成为目前抗氧化剂发展的一个必然趋势。在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的诳寡趸锎嬖谑盇的产生会被抑制，在由图我们可以得出，除了黄秋葵植物提取液，其他种植物提取液都具有，杨梅渣的总抗氧化能力一般，为图各植物提取物总抗氧化活性浙江工商大学硕士学位论文，其次是石榴皮本章小结同时兼顾抗氧化活性对食品保鲜的作用，从种常见的中草药和植物中筛选鱼糜天然保鲜剂的提取源。抑制沙雷氏菌活性较高的分别是魔芋、杨梅渣、桑叶。黄连虽然对假单胞菌有较强的抑制作用，但对沙雷氏菌几乎没有抑制活性。同样，魔芋虽然对沙雷氏菌有较强的抑制作用，但对假单胞菌大的抑制活性较弱。杨梅渣提取物显示出了更强的整体抑制作用，综合抑茵效果、生产成本等多方面因素，确定杨梅渣提取物为候选的天然抑菌剂。，其次是黄芩，淡竹叶，大黄，虎杖，杨梅叶。杨梅渣提取液的总酚含和抗茵活性奠定了基础。杨梅渣的总抗氧化能力和自由基清除能力一般，半抑浙江工商大学硕士学位论文前言新鲜鱼类的腐败主要表现在某些细菌生长和代谢生成胺、硫化物、醛、酮、酯、有机酸等，产生不良气味和味道，使产品变得感官上不可接型。】。为了鱼品的保鲜防腐，国外对新鲜鱼类腐败细菌进行了长期研究，逐渐明确了虽然鱼体最初会受到多，俊舛許进行的研究表明，寒带和温带海域捕获鱼类有氧冷藏中，特定腐败菌是耐冷的革兰氏阴性菌假单胞菌、沙霄氏菌和希瓦氏菌，真空或气调包装杨梅是巾国的特色浆果，产量逐年增加。据文献报道，杨梅果和杨梅汁中含有大量的酚类物质并具有较好的抗氧化活性】。随着果蔬加工技术的发展，杨梅汁、杨梅酒等己形成工业化生产规模，由此产生大量未经利用的杨梅渣。杨梅残渣占杨梅果实的左右。有关杨梅化学成分的研究己取得了很大进展，研究表明杨梅果实中含有葡萄糖、槲皮素艋仆嗷衔铩，广泛存在于杨梅、苹果、柑橘等植物的花、叶、果实中，具有抗菌、降血压、降血脂、调节机体免疫，清除自由基等多种生理功用强于革兰氏阳性菌。本章以杨梅的果渣为研究对象，从抑菌活性的方面阐述杨梅渣的功能特性，为杨梅渣的综合利用提供理论依据。杨梅渣购自浙江慈溪海通有限公司。浙江工商大学硕士学位论文后使用，详见表。，高的不锈钢杯，重量误试验标准筛浙江省上虞市纱筛厂制造；高速万能粉碎机天津市泰斯特股份有限公司。实验方法干燥。雷氏菌，假单胞菌为营养琼脂培养基，短乳杆菌为乳酸细菌培养基，异常汉森酵母为马铃薯葡萄糖肉汤培养基直鹪谑实钡奈露认屡嘌，细菌悬浮液的痬夯朴冢储藏备用。浙江工商大学硕士学位论文。提取物进行冷杀培养基和细菌菌悬液混合，下震荡培养，硫酸链霉素为阳性对照。问隔一悬浮液巾的菌数在觯痬保虬丛考尤耄蝗绻个时，则按约每个平板直接注入鉴定用培养基，凝固后备用。采用在牛津杯中加入一定剂量生物保鲜剂，在琼脂平板上扩散，根据抑菌圈直径大小来定量测定其抑菌效果。方法是将不锈钢牛津杯，轻轻垂直置于上层带定量规定试验菌琼脂平板上，杯中加入一定剂量的被测生物保鲜剂配制液，小心平置于培养箱中培养抑制杯周围的菌孢子生长，从而产生不长菌的透明抑菌圈，抑菌圈直径越大，则表明抑菌效果越显著。结果与讨论从乙醇粗提物中萃取得到的四相提取率从到不等。水相在这四相中有着最高的提取产量。正丁醇相的提取率也较高，是乙酸乙酯相的倍。提取率按降序依次为水相正丁醇相石油醚相乙酸乙酯相。从乙醇粗提物中萃取得到的四相萃取率萃取相鮟时图四相萃取物对沙雷氏菌的抑制活性图四相萃取物对假单胞菌杆菌的抑制活性中药的药理活性与其有效成分密切相关，研究发现中药的主要有效成分是生物为指示菌，比较各相的抑菌活性。由图和图为四相提取物对沙雷氏菌和假单胞菌的抗菌活性，其中阳性对照链霉素的活性对两种菌的活性最高，乙酸乙酯相对沙雷氏菌和假单胞菌的活性显著高于其他三相南喽粤街挚咕钚园凑战敌蛭毫疵顾阳性对照乙酸乙酸乙酯相为抑菌防腐剂。蠲吩崛镒畹鸵志及与茶多酚联用后的抑菌活性为较全面的检测杨梅渣提取液的抑荫活性，实验通过抑茼圈法测定杨梅渣对常见菌。参考市场上常用的天然抑菌剂茶多酚，检测与其联用后的效果。性和革兰氏阴性细菌都有抑制活性。在三种革兰氏阳性菌中，藤黄微球菌对粗提物最敏感宜嵋阴啵枷啵瓒喾樱宜嵋阴茶多酚，正丁醇相瓒喾拥腄。其次是金黄色葡萄球菌，宜嵋阴啵枷啵瓒喾樱宜嵋阴茶多酚，正丁醇相瓒喾拥腄值分别为，假单胞菌C舾校舾卸茸畹偷氖谴蟪司燃俚C舾校舾卸茸畹偷氖谴蟪司革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌敏感，鱼糜中的两科，腐败优势菌中主要是革兰氏阴性菌，此，认为杨梅渣提取液对鱼糜有潜在的保鲜作用。当粗提物与茶多酚联用时，实验组在金黄色葡萄球菌，假单胞菌，人肠杆菌有微小的叠加效应。细胞膜成分和排列的不同是革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌敏感度高的主要原因。革兰氏阳性菌包含有一个外肽聚糖层，它渗透屏障作用较弱，革兰氏阴性菌对抗菌物质的抵抗性可能是由于外层带有参与构造脂多糖成分的磷脂膜的缘故，它使脂溶性溶质不能渗透，构成了对亲水性溶质具有选择性的屏障。等【】的研究也得到了类似的结果从小叶藤黄和大果藤黄的果皮中用正己烷和氯仿提取得到的粗提物的抗菌活性，对被测的革兰氏阳性菌的效果比对被测的革兰浙江工商大学硕十学位论文。千腘一小璺心价椤绮罚種。卜。刊。啦畁蕖般輈癬【楹赳医皿州褂唬鹆氪纾甀一籽掘姻极州粗盟壶啦州褂昏。轓一凸籒癗罂链卜茸禽输糅罂龃心甾门裔掩枨匪茛掣区丑翅长罢龃闷瀣闷佃圃韫幂一旨“【“蜷粗留鬲姑犍求廿鹾删“【続【墨【粗蛆区噬川褂【疽籋“続綹綹粗趟击臣皿圳抖粗士甾辞雅回极删酱器槭艟荆甠【罂韶门滏门罢咎卜目裔蚺妊浙江工商大学硕士学位论文本章小结正丁醇相石油醚相乙酸乙酯相。对沙雷氏菌和假茶多酚，乙酸乙酯相瓒喾樱枷茶多酚的捣直鹞，俚C舾校舾卸茸畹偷氖谴蟪司燃俚糜保鲜实验。我国是世界渔业大国，水产品总产量和出口量均居世界首位。从年至水产品出口贸易连续位居世界第一，年我国水产品进出口总量达万吨，同比增长，成为世界水产品贸易的“领头羊”。鱼糜制品作为一种新型的水产食品，于世纪年代迅速发展。由丁鱼糜制品加工原料不受鱼体大小、种类的限制，为低值鱼、小杂鱼以及水产加工下脚料的综合利用和深加工提供了出路，提升了其附加值。因此，鱼糜制品已成为日前经济意义最大、附加值最高，也是最具代表性的加丁水产品，已成为多数发达国家水产品加工行业的主流，产业发展前景广阔。植物中的天然抗菌物质是由植物受到微牛物侵袭诱导产牛的远前体合成，或由植物被天然的或人造化合物诱导禞的远前体合成。包括植物抗毒素类、酚类、有机酸类和精油类等。植物提取物作为灭然的食品添加剂不仅在防腐方面具有突的效果，在抗氧化活性方面也表现突出，在食品保藏方面具有广阔的应用前景。本章应用杨梅渣提取液乙酸乙酯相组分以及茶多酚作为天然保鲜剂，加至鱼糜制品中，通过检测角糜制品的新鲜度和色泽，讨论杨梅渣提取物的对负糜制品的保鲜效果。浙江工商大学硕十学位论文冷冻梅鱼鱼糜浙江兴业集团有限公司提供。沙雷氏菌专用培养基、假单胞菌专用培养基杭州吴天试剂有限公司。，内径，高的不锈钢杯，重量误实验方法鱼糜制品配方痥、马铃薯淀粉。鱼糜制作过程混合物经入乙酸乙酯相痥，条多酚痥，乙酸乙酯瓒喾觃分装入无菌蒸煮袋恒温煮沸淙于微生物及生化分析。浙江工商大学硕士学位论文合物用均质机，均质忝又破吩谖蘧跫露缢椋剁碎的肉混合以颜色是最重要的感官属性，它决定着接受率冒煌崛锏鱼糜来分析色度。亨特的颜色值是用渲培养琌，琔按使用说明培养挑取以上单菌落，在各自的鉴别性培养基上再纯化分离一次，从第二次培养的单分析活性持续时间，在，】描述的实验基础上进行修改。从鱼糜原料茶多酚的活性持续时间。菌苔和抑菌圈变得明显后，在特定时间测定所有牛津杯的抑制距离。测量时，主要测量四个等距离的位置，直径表示为每个的距离的平均值。每天测定一次，总共进行天。所有的试验都做了三组重复。对于一个完全随机的设计，通过使用统计分析的方法，三组数据进行方差分析。运用软件浙江工商大学硕士学位论文忝又破纷苌鹗图储藏过程中，鱼糜制品的总生菌数的变化微生物的增长是食品变质的主要原因，植物提取物对广泛的微生物的抗菌作用已得到充分说咧】。储藏过程中，通过额定鱼糜制品中总菌数，评定鱼糜的的变质情况，具体见图。下的热处理在去除鱼糜中的腐败菌时起了重要作用。第欤氩瓒喾幼椋宜嵋阴茶多酚组及对照组相比，乙酸乙酯组的总菌数果显示在室温贮藏期间，对照组和茶多酚处理过的羊肉的微生物的形态特征。如果浙江工商大学硕士学位论文旌蠊鄄斓剑攵哉掌废啾龋天的储藏期结束时被处理样品中的腐败菌显著乙酸乙酯相和茶多酚的广谱抗菌活性是由于多酚化合物的存在，它作用于微生物细胞，导致细胞物质泄漏，也影响了虳的代谢取已经证实了绿茶酚类化合物对一些食源性细菌有抑制活性。一些食品的视觉感知可能会被改变，因为很多植物提取物是深色的。颜色的改变程度取决于提取物的颜色和水平以及食品基质成分的性质。因此，对影响食品最终颜色的提取物评估很重要。通过在鱼糜制品中加入杨梅提取物和茶多酚，而导致的颜色改变，用亨特色差仪测定，亮度琣焐，黄色珽苤。颜色值数时为绿色；担夯粕U时为灰色，负数时为蓝色。挡舛和鱼糜制品的颜色参数和颜色稳定性记录在表中。仍在可接受的范围内。但加有茶多酚的一组与对照组相比，存在显著性的差异说明杨梅渣提取的加入对鱼糜的原始白度影响较小，适合在鱼糜生产中添加，而茶多酚虽然抑菌效果较好，但其颜色较深，与原始的鱼糜制品有明显差异，对鱼糜感官有影响，所以不宜多加。最好的解决途径就是两者联用，在抗菌效果和颜色影响上相互补充。影响鱼糜颜色的稳定性有很多，主要是脂质的过氧化产物】。杨梅提取物中的高多酚含量和高抗氧化活性已有很多报道，并结合此次试验的结果推测，在维持鱼糜颜肌肽稳定了储存在的生牛肉的颜色。该研究结果支持了本次研究的结果。淋吣孕墨醉寸强魖鼎盏融好藩烘安玲藩淞。孙潞吼认认士吼口烈唬吼潞。冲潞。冲越乱冲濉吼冲浙江工商大学硕士学位论文图提取物对鱼糜制品中的腐败菌的抑制持续性抗菌剂的体外活性持续时间测定，是通过牛滓杯法测定乙酸乙酯相，茶多酚和乙菌活性明显高于茶多酚溶液，天后，其最终抗菌活性明显高于乙酸乙酯相，和茶多酚没有显著差异。该结果同时论证了以鱼糜为原料的制品的总菌数的结果。等【峙艮道称，穿叶眼子菜提取物中的抗菌剂的体外活性持续时问，是通过藤黄微球菌作为指示菌进行评估的。可观察到，菌苔在下培养旎蛘咴屡嘌天就形成了。时产生的抑制作用较小，并逐渐开始减小。据结果推测，联用后的抑菌剂具有比茶多酚要好的抑菌初始活性，同时具有较好的抑菌活性持续性，我们认为联用剂具有较好的应用潜力。本章小结本章将抑菌剂应用至鱼糜制品，通过检测其新鲜度和色度，考察抑菌剂的应用效浙江工商大学硕士学位论文乙酸乙酯相，茶多酚，乙酸乙酯相瓒喾涌梢越忝硬返谋势谘映天，浙江工商大学硕士学位论文前言抑菌剂对微生物的抑制作用是通过影响细胞亚结构而实现的，这些亚结构包括细胞壁、细胞膜、与代谢有关的酶、蛋白质合成系统及遗传物质。由于每个亚结构对菌体而言都是必须的，因此食品防腐剂只要作用于其巾的一个亚结构便能达到杀菌或抑细胞壁和细胞膜系统；饔糜谝糯镏驶蛞糯峁梗作用于酶或功能蛋白。碱性磷酸酶是存在于细胞壁与细胞膜之间的一种酶，正常情况下在胞外不能检测到其活性。但当细胞壁或细胞膜遭到破坏时，细胞通透性增加，将其泄漏到细胞外，考马斯亮蓝比色法是年由等人建立的一种测定微量蛋白质的方法，考马斯亮蓝所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作处有最大吸光度，因此通过定量测定染料的蓝色离子的量就可以算出蛋白质的量。本章通过检测细菌细胞壁、细胞膜通透性，可溶性蛋白质含量，电子显微观察等方面探索杨梅渣提取液对细菌的抑制机理，为全面解释杨梅渣提取液的抑菌效果铺垫基础。杨梅渣购自浙江慈溪海通有限公司。考马斯亮蓝杭州惠普试剂公司；牛血清蛋白浙江华东医药试剂公司。后使用。详见表。旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；瓺台式恒温振荡器江苏省太仓市实验设备厂；微量分析天平上海精科仪器有限公司；试验标准筛浙江省上虞市纱筛厂制造；高速万能粉碎机天津市泰斯特股份有限公司；扫描电子显微镜飞利浦公司；型透射电子显微镜日本公司。试验方法物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。浙江工商大学硕士学位论文采用考马斯亮蓝簍色法测定杨梅渣醇提物溶液对大肠杆菌可溶性蛋白质含量的影响。在无菌条件下，将杨梅渣醇提物溶液按一定比例加正丁醇相培养液后，加，震荡培养。准确吸取所得细菌用生理盐水洗涤次。样品的固定和脱水分前固定和后固定，前固定液脱水后的样品用环氧树脂包埋，再用型超薄切片机切片，切片厚度小于。用铜网捞起切片、晾干备用。先用拇姿嵫跤巳旧，水洗后再用柠檬酸铅染色。染色后经涂碳膜，在型透射电镜下观察。着许多细菌，作为扫描电镜的材料。样品的固定和脱水固定分前固定和后固定。前固定液位含有前固定液位含有戊二醛的疞磷酸缓冲液、为。将附着有细菌的盖玻片在前固定液用系列浓度梯度的乙醇溶液、脱水，每种浓样品的干燥和金属蒸涂采用临界点干燥法，将样品放入临界点干燥器的承压样浙江工商大学硕十学位论文，逐渐减压，历时。用双面胶带纸将样品粘附在铜块上，放入真空蒸涂器内用金片蒸涂，供扫描电镜观察。碱性磷酸酶位于细胞的细胞壁和细胞膜的间隙之中，在正常情况下不向外分泌，只有当细胞壁的通透性增大后，碱性磷酸酶才会释放到细胞体外。图提取物对沙雷氏菌细胞壁通透性的影响浙江工商人学硕十学位论文图提取物对藤黄微球菌细胞肇通透性的影响当微牛物处于不利环境或受到药物毒害时，往往会导致其生物膜流动性降低和半透性丧失，此时细胞内钾离子等电解质大量外泻，培养液电导率的改变可以反映细胞膜渗透性的改变，这些离子的丢失导致多种代谢途径受阻，同时影响多种酶的活性以及膜的稳定性；另一方面膜流动性降低也影响细胞内外渗透压的调节，使细胞吸胀破裂受损甚至死亡。从图，杨梅乙酸乙酯提取物溶液作用粘性沙雷氏菌后，培养液电导率明显高液调到率持续增加，且处理后电导率变化的速率明显升高。杨梅正丁醇提取物溶液作用粘性沙雷氏菌后，培养液电导率变化较小，但远高于阴性对照组。这说明经经过杨梅提取物溶液处理的菌体细胞随着作用时间的延长均有细胞质渗漏，电解质的渗出量不断增大，可能造成细胞膜流动性降低，细胞内环境稳定性被破坏，从而导致原生质外渗，破坏菌体细胞，从而起到抑菌作用。培养液调到率持续增加。杨梅正丁醇提取物溶液作用粘性沙雷氏菌后，培养液电导率变化较小，但远高于阴性对照组。这说明经经过杨梅提取物溶液处理的菌体细胞随着作用时间的延长均有细胞质渗漏，电解质的渗出量不断增大，可能造成细胞膜流动性降低，细胞内环境稳定性被破坏，从而导致原牛质外渗，破坏菌体细胞，从而起到抑图提取物对沙雷氏菌细胞膜通透性的影响图提取物对藤黄微球菌细胞膜通透性的影响考马斯亮蓝比色法是年由等人建立的一种测定微量蛋白质的方法，考马斯亮蓝所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作处有最大吸光度，因此通过定量测定染料的蓝色离子的量就可以算出蛋白质的量。餐蛋白浓度图蛋白标准曲线至三高一弓昌图中阳性对照为链霉素。从图可以看出，杨梅乙酸乙酯提取物溶液作用粘性沙雷氏菌后，培养液中可溶性蛋白的含量比刚开始作用时略有增高，说明部分细菌细胞膜的通透性遭到破坏，使蛋白溢出。随后，蛋白含量降低，说明杨梅乙酸乙酯提取膜大量破裂，可溶性蛋白大量溢出。而杨梅正丁醇提取物溶液作用粘性沙雷氏菌后，培养液中可溶性蛋白的含量一直比最初少，说明杨梅正丁醇提取物溶液只能抑制细菌合成可溶性蛋白而不能是细胞膜破裂。从图可以看出，杨梅乙酸乙酯提取物溶液作用藤黄微球菌后，培养液中可溶性蛋白的含量比刚开始作用时变化不大，随后，蛋白含量降低，说明杨梅乙酸乙酯提胞膜大量破裂，可溶性蛋白大量溢出。而杨梅正丁醇提取物溶液作用粘性沙雷氏菌后，培养液中可溶性蛋白的含量一直比最初少，随时间延长，蛋白含量略有波动，说明杨梅正丁醇提取物溶液只能抑制细菌合成可溶性蛋白而不能是细胞膜破裂。在张新虎等人【】的研究中，发现苍耳提取物对番茄灰霉病菌的蛋白质的合成也有一定的抑制作用，在时，抑制效果最明显。本研究中添加提取物的培养液的蛋白含量增加，可能是由于假单胞菌和沙雷氏菌的细胞膜破裂，造成细胞质外泄，由于细胞质中含有大量蛋白质，从而培养液蛋白含量升高。在吕淑霞等人【】的研究中，发现乳酸链球菌素的作用使得金黄色葡萄球菌培养液蛋白含量也增大。浙江工商大学硕士学位论文图沙雷氏菌扫描电镜图通过扫描电镜观察，可以看到，正常牛长的沙雷氏菌菌体细胞形态大小基本一致，表面光滑，电子密度均匀一致，呈椭圆形，细菌分界清晰排列整齐，细胞壁完整，细牛长的菌落完整性较好，呈完整的球状，经杨梅提取物处理后的菌落聚集不完整，推断杨梅提取物对沙雷氏菌生长的群体效应有影响，很多致腐败性细菌只有在群体密度达到一定程度后才可导致食品腐臭发生，即受群体效应的调控。图沙雷氏菌超薄切片透射电镜图质具有破坏作用，从而抑制了荫体的正籰；长。浙江工商大学硕士学位论文本章小结运用生化分析结合电镜显微技术，从细菌的亚细胞显微结构探索了杨梅渣提取物的抑菌机制。结果发现，杨梅渣乙酸乙酯相提取物和正丁醇相可增加沙雷氏菌、假单胞菌胞内的碱性磷酸酶释放及菌体培养液电导率的升高；电镜显微结构进一步证明该提取物对细菌的破坏作用，透射电镜显示处理后的细胞内容物出现亏空。综合生化分析与电镜技术，表明该提取物对供试菌株细胞壁和细胞膜都有不同程度的破坏作用，通过抑制细菌的蛋白质合成，导致细菌生长受到抑制；同时破坏细菌的细胞壁和细胞膜，增加细胞膜与细胞壁的通透性，导致大量菌体胞内内含物释放，造成菌体的死亡。浙江工商大学硕士学位论文本论文针对当前鱼糜制品易腐变质、缺乏高效安全的保鲜剂这一困扰鱼糜制品加工成