山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究(可编辑)

山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究南京中医药大学硕士学位论文山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究姓名蔡小军申请学位级别硕士专业药理学指导教师许惠琴20080501山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究摘要第一部分高糖致肾小球系膜细胞增殖的影响摘要目的观察不同浓度的葡萄糖作用对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响。方法加入的葡萄糖终浓度分别为、/,在培养箱内孵育后,采用比色法于酶联免疫测定仪波长处测定值。结果高糖作用刺激增殖。删以上的高浓度葡萄糖对系膜细胞有促进增殖作用,在各种浓度中以葡萄糖对系膜细胞增殖作用最明显,。结论根据葡萄糖对系膜细胞增殖作用的量效及时效关系,我们选择浓度的葡萄糖作用为最合适的细胞刺激条件。关键词体外培养细胞增殖第二部分山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选一、体外筛选摘要目的运用中药血清药理学方法研究山茱萸活性部位群对高糖致增殖的体外抑制作用,并与总提取物组进行比较,优选山茱萸防治糖尿病肾病的最佳活性部位群组合。方法采用四甲基氮唑盐比色法。结果山莱萸各有效部位合理组合后,具有不同程度对抗高糖致的增殖作用,并呈一定程度的量效关系。结论初步确定山茱萸总苷配伍多糖为防治糖尿病肾病的最佳活性部位群。摘要关键词糖尿病肾病法血清药理学二、整体筛选、,】旦一、摘要目的研究山茱萸防治糖尿病肾病的药效物质基础,确定有效部位在药效靶点上的作用,追踪活性部位群。方法分离、纯化山茱萸中环烯醚萜总苷、三萜酸,多糖,以环烯醚萜总苷为基础将各有效部位进行合理组合,以模型下的降血糖、降血清尿素氮活,生及降肾指数为指标,并与总提取物组进行比较,筛选、确定山茱萸防治的有效部位群。结果山茱萸各有效部位合理组合后,均能延缓小鼠肾病变的进程及降低肾病变的严重程度,其中以山茱萸环烯醚萜总苷多糖小剂量组效果最佳。结论环烯醚萜总苷多糖为山茱萸防治的最佳活性部位群。关键词活性部位糖尿病肾病筛选第三部分山茱萸活性部位群对大鼠的作用及其机理研究一、山茱萸活性部位群对大鼠的作用研究一对大鼠体重、血糖及糖化血红蛋白的影响摘要目的观察山茱萸活性部位群对糖尿病肾病大鼠体重、血糖及糖化血红蛋白的影响。方法雄性大鼠,禁食小时后,一次性腹腔注射链脲佐菌素,小时后恢复饮食。周后测大鼠空腹血糖值,若血糖值者则纳入为糖尿病大鼠,并按血糖值随机分为模型组、卡托普利组、山茱萸活性部位群小,中、大剂量组。同期另设一正常组,每日灌胃给药一次,各组连续给药周。测定大鼠给药后第、周体重、给药后第、山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究周大鼠血糖以及给药后第周糖化血红蛋白,动态观察糖尿病肾病大鼠的演变及山茱萸活性部位群的防治作用。结果模型组大鼠的体重明显降低,血糖和糖化血红蛋白水平明显增加,与正常组比较有显著差异,经山茱萸活性部位群治疗后,大鼠的体重下降轻微减慢,血糖及糖化血红蛋白有较明显的下降,与模型组比较差异显著,。结论山茱萸活性部位群对糖尿病肾脏病变具有一定的防治作用,抑制的生成可能是其作用途径之一。关键词糖尿病肾病活性部位群血糖二对大鼠血清胰岛素及其敏感指数、肽的影响摘要目的观察山茱萸活性部位群对糖尿病肾病大鼠血清胰岛素及其敏感指数、血清肽含量的影响。方法雄性大鼠,禁食小时后,一次性腹腔注射链脲佐菌素,小时后恢复饮食。周后测大鼠空腹血糖值,若血糖值者则纳入为糖尿病大鼠,并按血糖值随机分为模型组、卡托普利组、山茱萸活性部位群小、中、大剂量组。同期另设一正常组,每日灌胃给药一次,各组连续给药周。于给药后第周测定大鼠血清胰岛素、肽,并计算胰岛素敏感指数,观察山茱萸活性部位群对糖尿病肾病的防治作用。结果周时,模型组大鼠的血清胰岛素水平,胰岛素敏感性指数及血清肽含量明显下降,与正常组比较差异显著。山茱萸活性部位群可以在一定程度上提高糖尿病时血清胰岛素水平及其敏感指数、改善血清肽含量,。结论山茱萸活性部位群对糖尿病肾脏病变具有一定的防治作用。关键词糖尿病肾病胰岛素胰岛素敏感指数肽摘要三对大鼠肾功能的影响摘要目的观察山茱萸活性部位群对糖尿病肾病大鼠肾功能的影响。方法雄性大鼠,禁食小时后,一次性腹腔注射链脲佐菌素,小时后恢复饮食。周后测大鼠空腹血糖值,若血糖值者则纳入为糖尿病大鼠,并按血糖值随机分为模型对照组、卡托普利组、山茱萸活性部位群小、中、大剂量组。同期另设一正常组,每日灌胃给药一次,各组连续给药周。于给药后第周,测定血肌酐、尿肌酐、尿微量白蛋白的含量,并计算肾小球滤过率实验结束时,取双肾去掉包膜称重并计算肾指数。观察糖尿病大鼠的肾脏损伤情况及山茱萸活性部位群的防治作用。结果周时,模型组大鼠尿肌酐含量显著降低,血清肌酐、尿微量白蛋白及肾指数明显升高,肾小球滤过率明显增加,与正常组比较差异显著,。经山茱萸活性部位群治疗后,各组大鼠肾功能指标能显著改善,与模型组比较差异显著,。结论山茱萸活性部位群对糖尿病肾病大鼠的肾脏具有保护作用,能延缓其病理学进展。关键词糖尿病肾病肾功能尿微量白蛋白四对大鼠胸主动脉、肾组织形态学的影响摘要目的从形态学的角度探讨山茱萸活性部位群是否具有防治实验性糖尿病肾病的作用。方法雄性大鼠,禁食小时后,一次性腹腔注射链脲佐菌素,小时后恢复饮食。周后测大鼠空腹血糖值,若血糖值者则纳入为糖尿病大鼠,并按血糖值随机分为模型组、卡托普利组、山茱萸活性部位群小、中、大剂量组。同期另设一正常组,每日灌胃给药一次,各组连续给药周。实验结束后,用光镜观察肾组织及胸主动脉内皮细胞的形态改变等。结果模型组肾小球毛细血管丛体积略增大,部分毛细血管腔可见,系膜区增宽,深伊红染,球囊腔狭窄,但未见明显上皮增生及渗出物。少数肾小管上皮细胞空泡变糖原空泡。胸主动脉血管壁全层内出现山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究大量泡沫细胞,泡沫细胞呈圆形、体积较大,内膜平滑、无突起,泡沫细胞聚集处血管壁轻度增厚,管壁未见明显的纤维组织及平滑肌增生。而山茱萸活性部位群中、大剂量组上述病变明显减轻。结论从山茱萸活性部位群能保护糖尿病肾病大鼠肾脏等组织形态学病理改变,我们推断山茱萸活性部位群能有效防治糖尿病肾病。关键词光镜肾脏胸主动脉二、山茱萸活性部位群对大鼠的作用机理研究一对大鼠血清脂质的影响摘要目的通过对大鼠血清总胆固醇、甘油三酯、高密度酯蛋白及低密度酯蛋白的测定,初步探讨脂质代谢紊乱对由诱导的糖尿病肾病大鼠的影响及山茱萸活性部位群的保护作用。方法雄性大鼠,禁食小时后,一次性腹腔注射链脲佐菌素一,小时后恢复饮食。周后测大鼠空腹血糖值,若血糖值者则纳入为糖尿病大鼠,并按血糖值随机分为模型组、卡托普利组、山茱萸活性部位群小、中、大剂量组。同期另设一正常组,每日灌胃给药一次,各组连续给药周。给药周后,采用试剂盒测定、及的含量。结果造模后周,模型组大鼠血清、及水平明显升高,明显降低,与正常组比较有显著性差异各给药组与模型组相比、及降低,升高,差异具有显著统计学意义,。结论山茱萸活性部位群对糖尿病肾病的保护作用可能与其改善脂质代谢紊乱有关。关键词糖尿病肾病活性部位群脂质代谢摘要二对大鼠肾脏氧化应激的影响摘要目的通过大鼠肾组织中、值的变化分析,初步探讨由诱导的糖尿病肾病大鼠模型的氧化应激现象,以及山茱萸活性部位群保护肾脏作用机制。方法雄性大鼠,禁食小时后,一次性腹腔注射链脲佐菌素,小时后恢复饮食。周后测大鼠空腹血糖值,若血糖值者则纳入为糖尿病大鼠,并按血糖值随机分为模型组、卡托普利组、山茱萸活性部位群小、中、大剂量组。同期另设一正常组,每日灌胃给药一次,各组连续给药周。实验结束后检测肾组织中、的活性。结果造模周后,模型组肾组织下降、升高,与正常组比较差异显著。提示氧化应激水平明显增加。山茱萸活性部位群治疗后,各组大鼠肾组织升高、下降,与模型组比较具有显著性差异,。结论氧化应激参与了糖尿病。肾病得发病过程,山茱萸活性部位群对的治疗作用部分是通过抗氧化实现的。关键词糖尿病肾病氧化应激二对大鼠血清、和血浆、的影响摘要目的探讨山茱萸活性部位群对、的影响,以了解其对糖尿病肾病大鼠的作用及其作用机理。方法雄性大鼠,禁食小时后,一次性腹腔注射链脲佐菌素,小时后恢复饮食。周后测大鼠空腹血糖值,若血糖值者则纳入为糖尿病大鼠,并按血糖值随机分为模型组、卡托普利组、山茱萸活性部位群小、中、大剂量组。同期另设一溶媒对照组,每日灌胃给药一次,各组连续给药周。实验结束后取血,测定大鼠血清、血浆及血栓素。结果造模周后,模型组大鼠血清、明显降低,而血浆和血栓素的含量明显升高,与正常组比较差异具有显著统计学意义。经山茱萸活性部位群干预后,各组大鼠血清、水平增加,血浆和血栓素含量明显降低,与模型组山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究比较具有显著性差异,。结论山茱萸活性部位群可部分恢复和的动态平衡及血浆水平,对糖尿病大鼠肾脏病变有一定的保护作用。关键词糖尿病肾病四对大鼠红细胞膜上酶的影响摘要目的观察山茱萸活性部位群对糖尿病肾病大鼠红细胞膜上酶活性的作用。方法雄性大鼠,禁食小时后,一次性腹腔注射链脲佐菌素,小时后恢复饮食。周后测大鼠空腹血糖值,若血糖值者则纳入为糖尿病大鼠,并按血糖值随机分为模型组、卡托普利组、山茱萸活性部位群小、中、大剂量组。同期另设一正常组,每日灌胃给药一次,各组连续给药周。实验结束后采用酶试剂盒及考马斯亮兰蛋白试剂盒测酶活性的改变。结果模型组红细胞膜上定糖尿病大鼠红细胞膜上酶活性明显降低而山茱萸活性部位群能显著改善红细胞膜上酶活性,具有良好的修复作用。结论山茱萸活性部位群可以通过改善红细胞膜上酶活性对糖尿病时肾脏产生保护作用。关键词糖尿病肾病酶第四部分山茱萸活性部位群急性毒性试验摘要目的测定一日内一次灌胃给予山莱萸活性部位群后小鼠及大鼠所产生的急性毒性反应和死亡情况。方法取禁食不禁水小时的清洁级小鼠和大鼠,雌雄各半。以最大浓度、最大容积一次灌胃给药,观察记录受试动物活动、行为及死亡等情况。结果一日内一次灌胃给药的小鼠最大给药量为/,是临床成人一日用量的倍一次灌胃给药的大鼠最大给药摘要量为/,是临床成人一日用量的倍。结论山茱萸活性部位群灌胃给药安全度较大。关键词活性部位群急性毒生试验大鼠小鼠山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究、,、/,摘要、曲、,百,山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究、,斗摘要,、一,。,、,山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究培,、分,摘要。/,、,、山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究,。,、百,摘要,、,一一,。,山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究,、茸,一一一,、,十摘要/,/,前言上上刖罱随着社会经济的发展和人民生活方式的改变,糖尿病己成为肆虐全球的一种流行性非传染病,它是一种有遗传倾向的慢性内分泌代谢紊乱性疾病,以血糖增高和尿糖为主要特征,进而影响多系统、多脏器的综合征。糖尿病严重威胁着人类健康,它与心血管疾病、肿瘤,被列为当今世界威胁人类健康的三大疾病。据统计,糖尿病患者己过亿,年我国糖尿病患者已由年的上升到。年国家卫生部疾病控制司统计,目前我国糖尿病患者高达万人,估计到年全球将有超过亿的糖尿病患者,中国将有超过万的糖尿病患者昭。而且随着经济条件的优化,其发病率有上升趋势。糖尿病患者若血糖长期升高又得不到控制,将会引发各种慢性并发症,它是糖尿病致死、致残的主要原因。其中糖尿病肾病是临床最常见的糖尿病微血管并发症之一,是糖尿病引起的以肾小球硬化为主要特征的一种终生性、难治性的肾脏疾病。糖尿病可以通过多种途径损害肾脏,这些损害可以累及肾脏的所有结构,从肾小球,肾小管,直到间质,都可有不同程度的病理改变。研究表明,糖尿病肾病可能是由代谢因素和血流动力学因素相互影响相互作用所引起。其具体发病机制主要是糖尿病时肾脏中糖依赖性途径被激活,引起蛋白质非酶糖基化终产物。沉积、氧化应激增加、多羟基化合物形成、血流动力学异常、微循环障碍、以及活性因子如、产生等,副,造成早期。肾脏肥大、高滤过、细胞外基质沉积,随后肾小球基底膜增厚、系膜扩张、毛细血管通透性增加,后期弥漫性的肾小球硬化最终引起肾衰竭等临床病理表现。糖尿病肾病,早期起病隐匿,易被临床忽视,进展也比较缓慢。流行病学研究表明,超过的糖尿病患者从产生糖尿病开始,经历年的时间将演变为临床糖尿病肾病盯,引。如一旦进入临床。肾病期,病情就将加速发展并会造成。肾脏不可逆的病理改变,从而导致终末肾功能衰竭。据报道,大约一的患者在年内从微量蛋白尿期可进展为临床蛋白尿期嘲,最终约死于慢性肾功能衰竭们。研究表明,糖尿病肾病的发生与糖尿病血糖控制好坏及糖尿病的病程密切相关,病人常因失治误治而延误病情,给社会和家庭带来巨大负担。因此,积极探讨早期的有效干预措施,寻找治疗糖尿病并发症的有效药物,延缓其发生和发展,已成为当前糖尿病及肾病学者共同研究的重要课题,并且具有十分重要的临床意义。糖尿病肾病的常规治疗主要是建立在严格的血糖控制、纠正代谢紊乱的基础上,山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究对减轻和延缓其发生发展起到定的作用。目前,国外对糖尿病肾病的治疗尚处于探索阶段,未找到有明显疗效的药物。针对糖尿病。肾病的发病机制,主要开发了一些如、抑制剂、抑制剂等药物,它们虽都能改善部分指标,但一般都没有确凿的远期治疗效果,而且大多具有不同程度的不良反应,同时也不能有效控制其并发症。因此,探索和开发中医药及其复方制剂治疗是今后的发展方向。中医学认为,发生是消渴病失治、误治和治之不当而产生的并发病,属于“消渴”、“虚劳、“水肿等范畴,临床以尿浊、水肿、眩晕等为主要特征。本虚标实,虚实夹杂为其病机特点。脾、肾、肝及气血阴阳之虚为本,气滞、湿阻、血瘀、痰聚为标。阴虚燥热、气阴两虚及阴阳两虚为其基本证型。糖尿病阴虚燥热日久,伤津耗气,阴损及阳,终成阴阳两虚脾肺肾诸脏皆损,而以伤肾为主是糖尿病肾病的基本病理发展趋势。近二十年来,在临床上我国中医药主要使用补气药如黄芪、补阴药如生地、山茱萸、麦冬等组合而成的复方药物来治疗糖尿病肾病,它们虽有一定的疗效,但组成成分不够明确。据此,本实验室年申报了省自然科学基金项目“山茱萸抗糖尿病血管病变的物质基础及作用机理分析。研究发现山茱萸有效部位环烯醚萜总苷对防治实验性糖尿病肾病大鼠具有较好的疗效,能改善大鼠肾脏、胸主动脉等病理性变化,能减少肾脏的形成,提高活力等作用,其有效成分莫诺苷能对抗高糖对内皮细胞的损伤。因此,把环烯醚萜总苷开发成中药新药,对糖尿病肾病患者无疑会带来福音,具有重大的社会效益和巨大的经济效益。此外,药理研究表明山茱萸中多糖等具有抗氧化、改善血液流变学等作用,三萜酸具有降脂作用。由此可见,对治疗糖尿病。肾病变不只是单一的环烯醚萜苷类成分,可能还存在着其他的活性成分。因此提出山茱墓多效应组分综合应题是否会通过作用在不同的靶部位,对治疗糖尿病竖病变在药效学上呈理协同作用,并达到标奎兼治本研究旨在根据糖尿病肾病的发病特点,通过体外法观察了山茱萸有效部位群及其不同组合对高糖致大鼠肾小球系膜细胞增殖的抑制作用,初步筛选和确定其治疗糖尿病肾病的物质基础及最佳活性部位群组合,再结合整体糖尿病肾病小鼠模型最终确定该处方的物质基础及最佳有效部位群组合。考察此活性部位群的急性毒性作用。整体实验中采用诱导大鼠糖尿病肾病模型,检测血糖、糖化血红蛋白、肾功能指标、肾脏、胸主动脉等组织形态变化、血脂、血流动力学变化情况、氧化应激以及红细胞膜上离子泵的功能等,来观察山茱萸活性部位群对糖尿病肾病的保护作用,以初步阐明其作用途径及机理,为中医药临床治疗糖尿病肾病提供可靠的实验依据,也为最终将山茱萸活性部位群开发成临床治疗的新药奠定基础。前言参考文献,。,一,一郭志新糖尿病高血压与糖尿病肾病的联系辽宁实用糖尿病杂志,刘志红,黎磊糖尿病肾病的临床表现实用内科杂志,陈秋,单味中药治疗糖尿病肾病研究述略中医药学刊,陈义华,詹锐义糖尿病肾病条处方药物分析新中医,本页请装订在学位论文封面后第页原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。出叩,学位论文作者需亲笔签名墨冬叫司年夕月,日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权南京中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口,在解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。请在以上方框内打“学位论文作者需亲日孓只毛导师需亲笔签名个人简历姓名蔡小军性别男民族汉籍贯江苏如皋出生年月年月日学习经历南京中医药大学中药学专业,获学士学位一,至今南京中医药大学中药药理专业硕士研究生在读期间发表论文葛根注射液对麻醉犬急性心肌缺血的保护作用中华中医药学刊,第一作者葛根注射液抗心肌缺血作用研究中药药理与临床,第一作者千金妇炎舒对盆腔炎的治疗作用研究时珍国医国药,第一作者,高糖敛肾小球系膜细胞增殖的影响第一部分高糖致肾小球系膜细胞增殖的影响糖尿病肾病,是糖尿病最严重的慢性并发症,是导致慢性肾功能不全的最常见病因之一,其发生及发展是多因素综合作用的结果,其中糖代谢紊乱、肾脏血流动力学的改变、多种细胞因子以及遗传背景均起非常重要的作用。肾脏组织病理学特征是肾小球肥大,细胞外基质堆积,基底膜增厚,肾小球系膜弥漫性或节段性扩张,最终导致肾小球硬化。肾小球,是糖尿病肾病的靶细胞,功系膜细胞能极其复杂。系膜细胞属于间质细胞,与成纤维细胞、平滑肌细胞具有相似的性质,能合成和分泌细胞外基质蛋白,对肾小球毛细血管网起着支撑作用,同时由于它的收缩性能对调节肾小球血流起着重要作用。系膜细胞和系膜基质是密不可分的整体,系膜基质是系膜细胞分泌产生的。无论在型还是型糖尿病,系膜区的扩张都是最重要的结构改变旧。形态学分析表明系膜扩张和严重程度密切联系,因而它成为目前糖尿病肾病实验研究工作的重点和热点。尽管型和型糖尿病发病机理不同,但是,他们都以持续高血糖为其基本生化特征。因此,在糖尿病肾病发病机理的研究中,高血糖对肾脏的影响一直是一个重要的研究领域。很多的学者以令人信服的临床研究资料肯定了高血糖在糖尿病肾病发生及发展中的作用,被认为是与糖尿病各种并发症关系最为密切的因素之一,而糖尿病患者长期持续的高血糖状态又可导致容易在肾内蓄积的糖基化终末产物的形成,肾脏是的清除器官。因此,肾脏易受到高血糖及由高血糖所产生的相关病理产物的损害。具体表现为肾小球系膜细胞上有受体,与系膜细胞上特异性受体结合后,能增加系膜细胞对细胞因子的释放和细胞外基质的产生,进而导致肾小球肥大和肾小球硬化的发生。还能与一些胶原蛋白发生交联,使蛋白质在组织中的沉积增加,细胞外基质成分经非酶糖化后具有抗基质降解酶的能力,在体内降解减慢,导致糖尿病肾病患者系膜基质堆积、肾小球和肾小管基底膜的增厚,选择性通透能力的丧失和蛋白尿的发生。以往研究表明,肾小球系膜细胞在高糖的刺激下,早期系膜细山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究胞在数量上增殖,分泌增多而导致了肾小球的肥大,肾小球滤过率降低,而超过后系膜细胞生长缓慢,数量减少,直至最后衰老死亡口。本研究为进一步明确高糖对系膜细胞增殖的影响,我们选择大鼠肾小球系膜细胞,作为靶细胞,用不同浓度的高糖作用,以明确最合适的细胞刺激条件,从而为体外建立合理、科学的高糖模型来筛选防治糖尿病肾病的药物提供实验基础。摘要目的观察不同浓度的葡萄糖作用对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响。方法加入的葡萄糖终浓度分别为、/,在培养箱内孵育后,采用比色法于酶联免疫测定仪波长处测定值。结果高糖作用刺激增殖。以上的高浓度葡萄糖对系膜细胞有促进增殖作用,在各种浓度中以葡萄糖对系膜细胞增殖作用最明显陋,。结论根据葡萄糖对系膜细胞增殖作用的量效及时效关系,我们选择浓度的葡萄糖作用为最合适的细胞刺激条件。关键词体外培养细胞增殖糖尿病肾病是糖尿病最严重和最常见的并发症之一。肾小球系膜细胞是肾小球固有的细胞,功能极其复杂,是肾小球中最活跃的反应性细胞,具有分泌细胞基质、产生细胞因子、吞噬和清除大分子物质及类似平滑肌细胞收缩的功能。系膜细胞的增殖、肥大是糖尿病肾病的病理基础,在糖尿病肾病发生发展过程中起着重要作用。高血糖状态是糖尿病肾病发生发展的重要危险因素,而糖尿病患者持续高血糖可促进蛋白质与糖的交链反应增加而产生蛋白质的非酶糖基化,肾小球系膜细胞即生存于糖化蛋白池中。因此,本研究选用大鼠肾小球系膜细胞作为靶细胞,应用比色法观察高糖对其增殖的影响,以选择合适的细胞刺激条件。实验材料试剂高糖致肾小球系膜细胞增殖的影响一培养基,。小牛血清,杭州四季清血清厂。胰蛋白酶,。磷酸盐缓冲溶液,分析纯,分析纯,吼分析纯,。分析纯,用蒸馏水配成,高压灭菌,保存。溶液四甲基氮唑盐,溶于磷酸盐缓冲溶液中,在电磁力搅拌机上搅拌,用的微孔滤器除菌,分装,保存备用。二甲基亚砜,。细胞株大鼠肾小球系膜细胞株,引自南京中医药大学中药研究院,由本实验室复苏、传代保存。仪器。培养箱,倒置显微镜,一,重庆光学仪器厂。超净工作台,苏州百神科技网络系统有限公司,苏州市洁净技术研究所。酶联免疫检测仪,。统计方法所有数据均用软件进行统计,实验数据以均数标准差表示,组间比较采用检验。实验方法细胞培养与传代大鼠肾小球系膜细胞,置于含的培养液中,于、饱和湿度培养箱内静置培养。待细胞完全融合成单层后,用胰蛋白酶消化,显微镜下观察可见大部分细胞从培养瓶中脱落,变成原球状,立刻倒去胰蛋白酶终止消化。用滴管吹打壁上的细胞使其完全脱落及分离,按的比例接种于细胞瓶内。一般天山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究换液一次,天传代一次,取对数生长期细胞用于实验。比色检测细胞活力大鼠肾小球系膜细胞经胰酶消化后,用含的培养液配制成单个细胞悬液,以个细胞/孔接种于孔培养板内。细胞贴壁后,血清饥饿,使同步化。吸取细胞上清液,同一水平孔并列,加入葡萄糖刺激液。对照组加生理盐水葡萄糖刺激液分组含葡萄糖、/,在、饱和湿度培养箱内培养,取出后每孔加入/的溶液,继续二甲基亚砜培养,终止培养后吸弃孔内培养上清液,并每孔加入终止反应,微型震荡器震荡,使结晶物充分溶解,立即在酶标仪上波长处进行光密度定量检测,以测得的光密度值反映细胞活性和数量的多少。结果作用后,以上的高浓度葡萄糖对系膜细胞有促进增殖作用,在各种浓度中以高糖对系膜细胞增殖作用最明显,见,。高糖致肾小球系膜细胞增殖的影响表卜不同浓度高糖对肾小球系膜细胞增殖的影响料,术术术舍/图不同浓度高糖对肾小球系膜细胞增殖的影响山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究讨论相差显微镜下正常系膜细胞呈短梭形、星形或树枝状,当细胞密集时可重叠生长。本实验采用法观察体外培养肾小球系膜细胞的增殖情况,用不同浓度的葡萄糖作用刺激细胞,结果提示高糖在一定剂量范围内有效促进细胞增殖,这与等报道的高糖对系膜细胞的作用相符,说明在糖尿病肾病致病中高血糖起着关键作用。高糖作用于系膜细胞后产生和分泌多种细胞因子,其中、血小板源性生长因子和成纤维细胞生长因子、一和等均可刺激系膜细胞增殖。促增殖因子作用于系膜细胞后,使细胞内发生一系列的生化改变,产生相应的第二信使,将首先激活早期生长反应基因一、等一些即早反应基因,许多促进系膜细胞增殖的因子可以快速诱导表达及蛋白合成,、高糖也可促进和表达,且表达强度与增殖程度呈正相关隅】。在各种细胞因子中,是最主要的抑制因子,对生长具有双向调节作用,低浓度/促进增殖,高浓度/则抑制增殖哺。本研究根据葡萄糖对系膜细胞增殖作用的量效、时效关系,结合相关文献报道,选择浓度的葡萄糖作用作为最合适的细胞刺激条件。高糖致肾小球系膜细胞增殖的影响参考文献,王谦,于玫,龚慕辛,等高浓度葡萄糖对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响中国病理生理杂志,/,一,山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究第二部分山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选一、体外筛选摘要目的运用中药血清药理学方法研究山茱萸活性部位群对高糖致增殖的体外抑制作用,并与总提取物组进行比较,优选山茱萸防治糖尿病肾病的最佳活性部位群组合。方法采用四甲基氮唑盐比色法。结果山茱萸各有效部位合理组合后,具有不同程度的对抗高糖致的增殖作用,并呈一定程度的量效关系。结论初步确定山茱萸总苷配伍多糖为防治糖尿病肾病的最佳活性部位群。关键词糖尿病肾病法血清药理学糖尿病肾病是糖尿病全身微血管病变的肾脏表现,病理诊断为肾小球硬化症。的病理特点是肾小球基底膜增厚和以肾小球系膜区为主的细胞外基质的沉积,导致弥漫或结节性肾小球硬化。大量的研究证实,肾小球固有系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞均可以合成和分泌细胞外基质的不同成分,但以系膜细胞最强,从而被认为是肾小球硬化的制造者。法测定结果显示蒯以上的高浓度葡萄糖对有促增殖作用,在各种浓度中以浓度糖作用对系膜细胞增殖作用最明显。因此,本实验根据葡萄糖对系膜细胞增殖作用的量效、时效关系,结合文献报道,选择浓度的葡萄糖作用为最合适的细胞刺激条件。在此基础上,采用法,结合血清药理学,观察了山茱萸不同活性部位群组合含药血清对高糖致大鼠肾小球系膜细胞增殖的体外抑制作用,并与一种血管紧张素转化酶抑制剂一卡托普利进行了比较,初步确定山茱萸防治糖尿病肾病的物质基础,从而为整体优选最佳活性部位群组合提供一定的参考依据。实验材料药物及试剂山茱萸药材购于河南西峡,经我校中药鉴定教研室吴德康教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉。山茱萸有效部位的制备环烯醚萜总苷山茱萸药材用倍量的乙醇提取次,每次小时,提取液浓缩水沉,将上清液加水定容至生药/,此提取液上大孔树脂进一步分离纯化,山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选上样后,用的醇,倍量进行洗脱,洗脱液浓缩,减压干燥至恒重,得到山茱萸环烯醚萜总苷,纯度马钱苷莫诺苷二苷总和总三萜酸山茱萸药材用倍量的乙醇提取次,每次小时,提取液浓缩、水沉,后,滤过,将沉淀减压干燥至恒重,得到山茱萸总三萜酸提取物,纯度。总多糖山茱萸药材用倍量水煎煮次,每次小时,提取液浓缩至,加乙醇至含醇量为,于一冰箱中静置小时,滤过,沉淀于真空干燥至恒重,得到山茱萸总多糖提取物,纯度号山茱萸总提物山茱萸药材用倍量乙醇提取次后,滤过,合并次醇提液,回收乙醇药渣加倍量水煎煮次后,滤过,合并水煎液将水煎液和回收乙醇后的醇提液合并,浓缩至原药材/。卡托普利片,中美上海施贵宝制药有限公司,批号国药准字。羧甲基纤维素钠,上海化学试剂站分装厂,批号。一培养基,。小牛血清,杭州四季清血清厂。胰蛋白酶,。二甲基亚砜,。磷酸盐缓冲液,、。、,均为分析纯,用蒸馏水配成,高压灭菌,保存。溶液四甲基氮唑盐,溶于,在电磁力搅拌机上搅拌数分钟,用的微孔滤器除菌,分装,避光保存。药物配制卡托普利用溶液配制成浓度为/溶液总苷取总昔,用溶液配制成浓度为/的药液总苷三萜酸取总苷和三萜酸,用溶液配制成浓度为/的药液溶液配总苷多糖取总苷和多糖,用制成浓度为/的药液总苷三萜酸多糖取总苷、三萜酸和多糖,用溶液配制成浓度为/的药液。茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究动物及细胞株雄性新西兰家兔,一,由南京中医药大学实验动物中心提供。大鼠肾小球系膜细胞株,引自南京中医药大学中药研究院,由本实验室复苏、传代保存。仪器型电热恒温水槽,上海精宏实验设备有限公司。酶联免疫检测仪,。培养箱,超净工作台,苏州百神科技网络系统有限公司,苏州市洁净技术研究所。倒置显微镜,重庆光学仪器厂。统计方法所有数据均用软件进行统计,实验数据以均数标准差表示,组间比较采用检验。实验方法含药血清的制备瞄雄性新西兰家兔只,随机分为组,即空白对照组等体积溶液卡托普利组。总苷/总苷三萜酸/总苷多糖/总苷三萜酸多糖/号/。各组每天灌胃给药次,每次给药容积均为/空白对照组每天灌服等体积溶液。连续给药天后,禁食小时,于第天末次给药小时后颈动脉取血,静置小时,离心,分离血清,废弃溶血血清,于水浴中灭活补体,经微孔滤器除茵,保存备用。细胞培养与传代大鼠肾小球系膜细胞,置于含的一培养液中,于、。饱和湿度培养箱内静置培养。待细胞完全融合成单层后,用胰蛋白酶消化,显微镜下观察可见大部分细胞从培养瓶中脱落,变成原球状,立刻倒去胰蛋白酶终止消化。用滴管吹打壁上的细胞使其完全脱落及分离,按的比例接种于细胞瓶内。一般天换液一次,天传代一次,取对数生长期细胞用于实验。茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选山茱萸对的影响呤取处于对数生长期的,经胰酶消化后,用含的一配制成单个细胞悬液。以个细胞/孔接种于孔培养板内。细胞贴壁后,换用不含血清的培养液使其同步,吸弃细胞上清液,同一水平孔并列,分别加入用配制的高糖刺激液,使其终浓度为,然后加入山茱萸不同活性部位群含药血清并分别用空白血清稀释倍、倍,卡托普利含药血清。同时设对照含空白血清的无的一液含葡萄糖的无的培养液上述含药血清不含刺激因素的无的一培养液。混匀后,在、。饱和湿度孵箱中培养,采用法来考察增殖情况。法测定细胞增殖细胞连续培养,取出后每孔加入新鲜配制的/的溶液,继续培养,吸弃上清液,然后每孔加入终止反应,微型振荡器振荡,使结晶物充分溶解,立即在酶标仪上波长处进行光密度检测。结果高糖中的吸收度值增加,与正常组比较,具有显著性差异,表明高糖能增加线粒体代谢产物的形成量,促进的增殖反应。在一培养液中加入山茱萸不同活性部位群组合的含药血清,对未见有明显影响,表明、给药剂量分别在/、/、/、/以下,对细胞基本无毒性。而高糖环境中加入、含药血清,则表现为对抗高糖致的促进反应,且呈一定程度的浓度依赖性。其中以大剂量效果最佳。结果见,。山茱萸防治糖尿病肾病活性部位群的筛选及其作用与机理研究表山茱萸活性部位群对高糖致肾小球系膜细胞增值的