[硕士论文精品]木糖代谢途径在酿酒酵母工业菌株中的建立

山东大学博士学位论文木糖转化乙醇代谢途径在酿酒酵母工业菌株中的建立摘要随着70年代的两次石油危机的出现，寻找可再生性的替代能源已成为维持人类社会可持续发展的紧迫任务。燃料酒精被公认为最有发展前景的可再生清洁能源之一。酒精生产再次受到人们的关注。自然界中含有丰富的植物纤维资源，而目前只有34的植物纤维资源被有效地利用。木糖是木质纤维素水解物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖。对木糖的生物转化生产乙醇是实现木质纤维素生物转化生产乙醇的关键环节。构建不仅能利用葡萄糖而且能利用木糖生产乙醇的代谢工程菌已成为当前转化木质纤维素类生物质生产燃料酒精的研究热点之一。酿酒酵母是传统上食品及化工工业的最佳生产菌株，在工业生产应用中有上百年历史的酒精发酵菌种，具有许多优良特性。然而酿酒酵母菌缺乏转化木糖生成木酮糖的酶而不能利用木糖，但能利用木糖的异构体形式木酮糖。因此，我们通过代谢工程METABOLICENGINEERING手段，在用于乙醇生产的酿酒酵母工业菌株中引入木糖代谢的关键酶基因，在酿酒酵母工业菌株中开辟木糖代谢途径，并得到了能发酵木糖产生乙醇的工程菌株。本文的主要研究内容为酿酒酵母工业菌株，其遗传背景、生长特征及内在的生理生化特征与实验室菌株有很大不同。首先，工业菌株往往没有常规酵母转化子筛选的营养缺陷型标记，只能利用某些显性标记，例如G418和CU“。其次，转化技术上也与对实验室菌株的转化有所不同，因此需要建立酵母工业菌株转化体系。本文通过敏感度实验测定了G418和CUZ作用于三株酿酒酵母工业菌株SK1、SPSC一1、NAN一27的最低抑菌浓度，发现三株菌对G418的敏感性差别很大，G418作用于SPSC1酒精酵母的最低抑菌浓度达到750陷，ML，对SK1酿酒酵母的最低抑菌浓度只有LOO_LTGMA。同株菌在不同的培养基上对铜离子的耐受性相差也很大，SPSCL酒精酵母在YEPD培养基上可以耐受15MMOLLCU“，但在YNB基本培养基上只可以耐受LMMOLLCU“。对工业菌株酿酒酵母进行醋酸锂法转化的系列条件做了研究，确定OD600值O810时是最佳细胞收获时间，转化子先在完全培养基上生长6H再涂布3418选择平板可以大大提高转化子的数量。通过改进的原生质体转化法，使含铜抗性基因的质粒KB806成功转入工业酵母菌株SPSC一1和4山东大学博十学位论文NAN一27中，初步解决了工业菌株转化难的问题。为了实现外源基因在工业酿酒酵母中的稳定表达，需要利用同源重组将外源基因整合到酵母工业菌株染色体上，YIP5是最常用的整合载体，然而它的拷贝数很低限制了外源基因的表达量。酿酒酵母RDNA在酵母基因组中有100200个重复单元，以此为整合位点可以提高外源基因的拷贝数，因此我们以YIP5为骨架构建了带有酿酒酵母RDNA片段、PGK强启动子及G418抗性基因的多拷贝整合载体PYMIKP。通过对PYMIKP遗传特性的研究，证实了这是一类用于对工业菌株进行基因工程改造的较理想载体。鉴于显性选择标记G418抗性基因对真核生物酵母菌的广泛适用性和不同酵母菌RDNA结构基因有很高的同源性，这类载体可望成为一种酵母表达系统通用载体。在真菌中，木糖转化为木酮糖的反应是在依赖NADPH的木糖还原酶XYLOSEREDUCTASE，XR作用下，将木糖还原为木糖醇，然后在依赖NAD的木糖醇脱氢酶XYLITOLDEHYDROGENASE，XDH作用下，转化木糖醇为木酮糖。接着木酮糖经木酮糖激酶XYLULOKINASE，XK磷酸化形成5一磷酸木酮糖，这步酶促反应是木糖代谢的限速步骤之一。因此我们将来自毕赤氏酵母PICHIASTIPITIS的木糖还原酶基因XYLL、木糖醇脱氢酶基因XYL2和酿酒酵母自身的木酮糖激酶基因XKSL连接到已构建的单拷贝整合载体PYIK和多拷贝整合载体PYMIK上。PGK和ADHL启动予均为酿酒酵母组成型强启动子，而PGK启动子的表达效力比ADHL启动子强。将XYLL基因置于乙醇脱氢酶启动子ADHL控制下，将XYL2基因置于磷酸甘油激酶启动子PGK控制下，从而控制木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的表达量，减少因木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的辅酶不能相偶联，细胞内氧化还原失衡所致的木糖发酵中的木糖醇积累。XKSL基因置于磷酸甘油激酶启动子PGK控制下。得到重组质粒PYIK一123和PYMIK127。在细菌中，木糖代谢途径是在木糖异构酶XYLOSEISOMERASE，XI的作用下，转化木糖为木酮糖。将来自于嗜热细菌THERMUSTHERMOPHILUS的木糖异构酶基因XYLA和酿酒酵母自身的木酮糖激酶基因XKSL连接入单拷贝整合载体PYIK和多拷贝整合载体PYMIK。将XYA、XKSL基因都置于组成型强启动子PGK启动子控制下，得到重组质粒PYIK一112和PYMIK一114。经APAI、STUI酶切重组质粒PYIK一123、PYIK一112使其线性化后转化入酿酒5山东大学博上学位论立酵母工业菌株NAN一27和实验室菌株H158中。在含G418和以木糖为唯一碳源的YPX平板上筛选转化子。得到含有单拷贝木糖代谢基因的重组酵母菌NAN123、H一123、NAN一112和H一112。在RDNA片段内部，用HPAL酶切重组质粒PYMIK一127和PYMIK114，使其线性化后转化入酿酒酵母工业菌株NAN一27和实验室菌株H一158中。在含G418和以木糖为唯一碳源的YPX平板上筛选转化子。通过提高G418浓度，增加筛选压力，并经过木糖生长测定进行二次筛选，得到含有多拷贝木糖代谢基因的重组酵母菌NAN一127、H127、NAN一114和H一114。经稳定性实验，证明重组菌在无选择压力的YEPD培养基中培养146个小时后，仍有96左右的细胞能在含G418的YPX平板上生长。重组菌在无选择压力的培养基中培养后，经酶活测定，木糖还原酶XR、木糖醇脱氢酶XDH、木糖异构酶XI、和木酮糖激酶XK均在酿酒酵母中得到活性表达。表明外源木糖代谢基因稳定存在于重组菌株中。RDNA介导的含有多拷贝木糖代谢基因的重组酵母菌的各酶酶活均高于含有单拷贝木糖代谢基因的重组酵母菌，表明RDNA的引入导致外源基因多拷贝整合入酵母染色体中，外源基因的表达量得到提高。将所构建酿酒酵母重组菌在氧气限量的条件下，进行木糖葡萄糖共发酵实验。重组菌的生长情况和宿主菌没有明显区别，表明外源基因的引入对重组菌的生长没有影响。发酵产物进行HPLC分析，结果表明各重组菌都能利用木糖产生乙醇。其中，以酿酒酵母工业菌株为宿主菌，多拷贝整合木糖还原酶XR基因、木糖醇脱氢酶XDH和木酮糖激酶XK基因的酿酒酵母重组菌NAN一127利用木糖生产乙醇的效果最优。对木糖的利用最高可达184GL，较宿主菌提高了2倍，乙醇产量最高可达7,9GL，较宿主菌提高39。由此在酿酒酵母实验室菌株和工业菌株中分别建立了细菌和真菌的两条木糖代谢途径。经过比较，发现由RDNA介导的多拷贝整合木糖代谢酶基因的重组菌对木糖的利用和乙醇的产生都高于单拷贝整合木糖代谢酶基因的重组菌。并且以酿酒酵母工业菌株为宿主菌的重组菌对木糖的利用和乙醇的产生高于以实验室菌株为宿主菌的重组菌，乙醇的产生速度也较实验室酿酒酵母重组菌快，表明不同遗传背景的宿主菌对构建利用木糖生产乙醇的工程菌有重要的影响。尽管构建的重组菌能利用木糖生产乙醇，但是对木糖的利用和乙醇的产量仍6山东大学博士学位论文离工业生产的需求有一定距离。首先木糖的运输阻碍了重组菌对木糖的利用；其次，分解木糖最初两步是在XR及XDH作用下的酶促反应，这两步反应的辅酶NADPH和NAD不能偶联，引起细胞内的氧化还原不平衡，导致木糖醇的积累，降低了乙醇的产量。虽然超表达木酮糖激酶XK基因，促进了乙醇的生成，但是仍不能消除细胞内的氧化还原不平衡。木糖异构酶直接完成木糖到木酮糖的转化，不需要任何辅酶，被认为是构建利用木糖酿酒酵母代谢工程菌株的便利途径。但是由于来自嗜热细菌的XI最适反应温度过高而在常规发酵温度下酶活相对低，使得木糖不能有效的转化为木酮糖。因此，需要进一步对嗜热细菌木糖异构酶进行诱变，使其在酿酒酵母发酵温度下仍具有较高酶活。关键词代谢工程，酿酒酵母工业菌株，整合质粒，转化体系，木糖，木糖醇乙醇7坐查盔堂堕主兰焦堡塞ESTABLISHMENTOFAXYLOSETOETHANOLMETABOLICPATHWAYINANINDUSTRIALSTRAINOFABSTRACTWITHTHEADVENTOFTHE“OILCRISIS”INTHE1970S，THEIMPORTANCEOFALTERNATIVEENERGYSOURCESGAVEBINH的INITIATIVESASASTEPTOSOLVETHISPROBLEMTHEADDITIONOFETHANOLTOGASOLINE，WHICHREDUCESEMISSIONOFCARBONMONOXIDEANDUNBURNEDHYDROCARBONSTHATFORMSMOG，HASWIDELYBEENENFORCEDINRECENTYEARSTHEDEMANDFORBIOETHANOLHASTHEREFOREINCREASEDTHEREISABUNDANCEOFLIGNOCELLULOSIEMATERIALSINTHENATURE，HOWEVERONLY34OFLIGNOEELLULOSICMATERIALSAREUTILIZEDDXYLOSEISTHEMOSTABUNDANTMONOSACCHARIDEINLIGNOCELLULOSEHYDROLYSATESAFTERGLUCOSECONSEQUENTLY，ETHANOLICFERMENTATIONOFXYLOSEISOFMAJORCONCERNFORTHEEFFICIENTUTILIZATIONOFLIGNOCELLULOSICHYDROLYSATESTOPRODUCEFUELETHANOLINTHERECENT20YEARSSACCHAROMYCESCEREVISIAEHASBEENTRADITIONALLYUSEDINPRODUCINGETHANOL，WHICHHASACQUIREDQUALITIESSUCHASHIGHETHANOLPRODUCTIVITY，TOLERANCETOPROCESSHARDINESS，TOLERANCETOFERMENTATIONBYPRODUCTSANDIS，THEREFORE，PREFERREDFORETHANOLPRODUCTIONFROMCROPSHOWEVER，印PLYINGSCEREVISIAEFORFERMENTATIONOFLIGNOCELLULOSICHYDROLYSATESHASTHEDRAWBACKTHATITCANNOTNATURALLYUTILIZEXYLOSE，ONLYITSISOMERXYLULOSEMETABOLICENGINEERINGCANBEUSEDTOEXTENDTHESUBSTRATERANGEFORGROWTHANDPRODUCTFORMATIONOFANORGANISMINTHISSTUDY，GENESENCODINGENZYMESFORXYLOSEMETABOLISMHAVEBEENINTRODUCEDINTOANINDUSTRIALSTRAINOFSACCHAROMYCESCEREVISIAETHEXYLOSEMETABOLICPATHWAYWASESTABLISHEDINTHEINDUSTRIALSTRAINOFSACCHAROMYCESCEREVISIAETHERECOMBINANTSTRAINSHAVETHEABILITYOFUTILIZATIONTHEXYLOSETOPRODUCEETHAN01THEMAINOBJECTIVESOFTHISRESEARCHAREASFOLLOWSTHEWILDTYPEYEASTS，FOREXAMPLETHEINDUSTRIALYEASTSTRAIN，AREMORECOMPLEXINTHEGENETICBACKGROUND，GROWTHCHARACTERSANDPHYSIOLOGICALCHARACTERSCOMPARING8山东大学博士学位论文WITHTHELABORATORYSTRAINSOTHETRANSFORMATIONSYSTEMOFYEASTINDUSTRIALSTRAINISNEEDEDBEESTABLISHEDFIRSTOFALL，INDUSTRIALSTRAINSCANONLYUSEDOMINANTSELECTIONMARKERGENES，FOREXAMPLEG418ORCU“，BECAUSEINDUSTRIALSTRAINSLACKAUXOTROPHICMARKERSFORGENETICMANIPULATIONSSECONDLY,THEREARESOMEDIFFERENCESOFTRANSFORMATIONTECHNOLOGYBETWEENINDUSTRIALANDLABORATORYSTRAINSSENSITIVITYOFTHREEINDUSTRIALSTRAINS，SK一1、SPSC一1、NAN一27，TOG418ANDCU2WERETESTEDTHESENSITIVITYOFTHREESTRAINSTOG418WASVERYDIFFERENTSPSC一1ALCOHOLYEASTSTRAINHADTHEMOSTENDURANCETOG418ANDCOULDGREWINMEDIUMHAVING75099MLG418SK一1WASTHEWEAKESTANDITCOULDNTGROWWHENMEDIUMHADG418EXCEEDING100ITGMLTHESAMESTRAINHADDIFFERENTENDURENCETOCU“ONDIFFERENTMEDIASPSC一1ALCOHOLYEASTCOULDENDURE15MMOLLCU2INTHEYEPDMEDIUMBUTITONLYCOULDENDURELRNMOLLCU“INTHEYNBMEDIUMWHENTRANSFORMEDBYLIAC，THEBESTCELLGROWTHTIMEOFINDUSTRIAISTRAINWASOD6000810ANDGROWINGFOR6HOURSONCOMPLETEMEDIUMBEFORETRANSFERREDTOG418SELECTIONPLATECOULDINCREASETHENUMBEROFTRANSFORMANTSSPHEROPLASTTRANSFORMATIONMETHODWASMODIFIEDTHETRANSFORMATIONSYSTEMSFORTHETHREEINDUSTRIALYEASTSTRAINSWEREESTABLISHEDTHEDEVELOPMENTOFTHETRANSFORMATIONSYSTEMSFORTHETHREEINDUSTRIALYEASTSTRAINSISESSENTIALFORIMPROVINGTHEYEASTSTRAINSBYMETABOLICENGINEERINGTHESTRATEGYFORDIRECTINTEGRATIONOFATARGETGENEINTOTHEHOSTCHROMOSOMEISANEFFECTIVEMETHODFORTHESTABLEEXPRESSIONOFFOREIGNGENESINTHEINDUSTRIALSTRAINOFSACCHAROMYCESCEREVISIAHOWEVER,MOTOTICALLYHIGHLYSTABLEYEASTINTEGRATINGPLASMIDSYIPAREARENOTADEQUATEFORBIOTECHNOLOGICALAPPLICATION，WHEREHIGHPRODUCTYIELDISTHEPRINCIPALAIM，BECAUSETHEIRCOPYNUMBERISVERYLOWRDNALOCUSCONSISTSOF150200TANDEMLYREPEATEDCOPYOFRDNAUNITINTHE量CEREVISIAEGENOMIC，SOTHATTHEFOREIGNGENESCOULDBEINTEGRATEDINHIGHCOPYNUMBERINTOTHE量CEREVISIAEGENOMICWECONSTRUCTEDANINTEGRATINGVECTORPYMIKPCONTAININGARDNAPORTIONASAHOMOLOGOUSRECOMBINATIONSEQUENCETOOBTAINMULTICOPYINTEGRANTSANDPGKLPROMOTERANDTERMINATOR，ANDWITHTHEG418RESISTANCEGENEKANMXASDOMINANTSELECTIONMARKERTHISINTEGRATINGVECTORISANIDEALVECTORFORCONSTRUCTIONOFTHEGENETICALLYENGINEERED量CEREVISIAETHATUSEDINDUSTRIALSTRAINAS9山东大学博士学位论文THEHOSTINTHENATUREAILYXYLOSEUTILISINGYEAST，THEFIRSTTWOENZYMATICSTEPSINXYLOSEMETABOLISMARECATAIYSEDBYNADPHDEPENDENTXYLOSEREDUCTASEXRANDNAD_DEPENDENTXYLITOLDEHYDROGENASEXDHXYLOSEISFIRSTREDUCEDBYXRTOXYLITOL，WHICHTHENOXIDISEDBYXDHTOXYLULOSETHENXYLULOKINASECONVEYSXYLULOSETOXYLULOSE5一PHOSPHATETHEXYLLANDXYL2GENE，WHICHENCODEXYLOSEREDUCTASEXRANDXYLITOLDEHYDMGENASEXDHFROMPICHIASTIPITIS，ANDTHEXKSLGENE，WHICHENCODESXYLULOKINASEXKFROMSCEREVISIAE，WERELIGATEDINTOTHELOWCOPYOFINTEGRATINGPLASMIDPYIKANDTHEMULTIPLECOPIESOFINTEGRATINGPLASINIDPYMIKTHEPGKANDADHLPROMOTERSARESTRONGANDCONSTITUTIVEPROMOTERS，OFTENUSEDFORHETEROLOGOUSGENEEXPRESSIONTHEPRESENCEOFTHEADHLSQUENCEMAYENHANCETHEEXPRESSIONOFTHEGENECONTROLLEDBYTHEPGKPROMOTERTHEXYLLGENEISUNDERTHECONTROLOFADHPROMOTERANDTERMINATOR,XYL2ISUNDERTHECONTROLOFPGKPROMOTERANDTERMINATORHIGHERSPECIFICACTIVITIESOFXDHTHANXRWEREOBTAINEDINTHE只CEREVISIAESTRAINSITISPOSSIBLETOREDUCETHEXYLITOLFORMATIONBYPRODUCEMOREXDHTHANXRXKSLISUNDERTHECONTROLOFPGKPROMOTERANDTERMINATORTHERECOMBINANTPLASMIDSWERENAMEDPYIKXYL23ANDPYMIKXYL27，RESPECTIVELYINTHEBACTERIA，DXYLOSEISOMERASECATALYSESTHEREVERSIBLEISOMERIZATIONOFDXYLOSETODXYLULOSEXIDOESNOTREQUIREREDOXCOFACTORSANDCANNOTGENERATECOFACTORIMBALANCEDURINGANAEROBICXYLOSEUTILIZATIONTHEGENEFORXYLOSEISOMERASEXYAFROMTHERMUSTHERMOPHILUSANDTHEENDOGENOUSGENEENCODINGXYLULOKINASEXKSLWERELIGATEDINTOTHELOWCOPYOFINTEGRATINGPLASMIDPYIKANDTHEMULTIPLECOPIESOFINTEGRATINGPLASMIDPYMIK，RESPECTIVELYTHEXYAANDXKSLGENESAREUNDERTHECONTROLOFPGKPROMOTERANDTERMINATORTHERECOMBINANTPLASMIDSWERENAMEDPYIKXYLL2ANDPYMIKXYLL4，RESPECTIVELYTHEPLASMIDPYMIKXYL23WASLINEARIZEDWITHAPAIANDPYLKXY一112WASLINEARIZEDWITHSTUL，WHICHGENERATEHOMOLOGOUSENDSTOINITIATEINTEGRATIONTHESEWERETRANSFORMEDINTOTHEINDUSTRIALSTRAINOFSCEREVISIAENAN27ANDLABORATORYSTRAINOFSCEREVISIAEH一158TRANSFORMANTSWERESELECTEDONYPXPLATESTHATHAVELN坐蔓奎兰堕主兰堡笙苎XYLOSEASTHESOLECARBONSONRCEANDTHATCONTAINEDG418，RESULTINGINRECOMBINANTSTRAINSNAN123、H一123、NAN一112ANDH112CONMININGTHEXYLOSEMETABOLIZINGGENESWITHALOWCOPYNUMBENTHEPLASMIDPYMIKXYL27ANDPYMIK114WASLINEARIZEDWITHHPAITOTARGETINTEGRATIONTOTHERDNAREGIONINTHEGENOMEOFTHEYEASTHOSTSTRAINTHESEWERETRANSFORMEDINTOTHEINDUSTRIALSTRAINOFCEREVISIAENAN一27ANDLABORATORYSTRAINOF丘CEREVISIAEH一158TRANSFORMANTSWERESELECTEDONYPXPLATESTHATHAVEXYLOSEASTHESOLECARBONSOURCEANDTHATCONTAINEDG418TOINCREASETHECONCENTRATIONSOFG418PROVIDSASTRONGERSELECTIVEPRESSURE，WHICHMAYHAVELEDTOHIGHERCOPYNUMBERSFURTHERSCREENINGWASPERFORMEDBYMEASURINGTHEBIOMASSFOLLOWINGGROWTHONYPX，RESULTINGINRECOMBINANTSTRAINSNAN一127，H一127，NAN一114ANDH一114CONTAININGMULTIPLECOPIESOFTHEXYLOSEMETABOLIZINGGENESMOREOVER,ABOUT96OFCELLSWERESTILLALIVEONYPXPLATESCONTAININGG418AFTER146HOFGROWTHWITHOUTSELECTIONPRESSURETHE曼CEREVISIAERECOMBINANTSWEREGROWNINYEPDWITHOUTG418ANDTHEYEXPRESSEDXR，XDHANDXKACTIVITIESTHISINDICATESTHATRECOMBINANTSTRAINSARESTABLEANDEXPRESSIONSOFTHEGENESWERENOTLOSTOVERTIMETHESPECIFICACTIVIT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料的供应将受到很大限制而且成本过高。山东大学博士学位论文2000年我国粮食产量达O92万亿斤，而人口却高达13亿，人均粮食占有量还不到800斤，低于1984年850斤的水平，每年缺少粮食约2000亿斤，世界粮食市场很难填平这一缺口，因此，未来的中国粮食生产形式将十分严峻。同时，在我国年产的150200万吨酒精中不包括饮料酒，70是以大米、玉米、薯干等粮食为原料进行生产的。近年来，随着改革开放的不断深入，粮食价格不断放开，使得大多数以粮食为原料的酒精生产企业难以为继，经济效益下降甚至出现负效益。因此，随着世界人口增加，耕地减少，用粮食换燃料的方法在国际上也不可能广泛和持久地采用。而我国纤维素类可再生资源丰富，农作物的秸杆6亿多吨P1。除部分用于造纸、建筑、纺织等行业外，大部分未能被有效利用，有些还造成环境污染。若能采用适宜的技术将这些废物加以转化利用，不仅能够节粮、代粮，缓解能源紧缺，还可以处理废物、消除公害、保护环境，对我国经济的可持续发展将产生深远的影响。因此开发廉价的燃料酒精生产原材料是此能源领域研究的主要方向之一。木质纤维索作为光合作用的产物是地球上最丰富的可再生资源，充分将其中可利用的成分转化为燃料酒精，不仅能为人类提供数量可观的新型能源，而且可以在很大程度上减轻对生态环境造成污染。在国际能源组织INTERNATIONALENERGYAGENCY和各国政府的帮助下，14个国家和欧洲共同体的科学家们联合签定了生物能协议BIOENERGYAGREEMENT，共同致力于利用植物纤维资源制取燃料酒精的研究和开发工作。近二十年来在原料预处理、菌种筛选与选育、纤维素酶制备和酶水解技术、酒精发酵技术上取得了令人瞩目的进展。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素、木质素组成。纤维素是由葡萄糖残基经B14糖苷键连接成的不分支结晶状多聚体；半纤维素是多种糖分的非结晶异质多聚体，包括阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖和木糖等。有关纤维素的生物降解早在60年代就已开始，但由于纤维素、半纤维素和木质素在植物中形成具有物理、化学结合的复杂的三维聚合物，使得纤维素的生物利用受半纤维素和木质素的空间阻碍，自七十年代以来，有关生物质的全利用问题已成为植物原料再生性能源开发的关键。各种生物质原料的组成见表卜2ARISTIDOUETA12000。在农业废弃物如玉米秸中三者的含量大约是3040纤维素、2030半纤维素、1025木质素。如果将其中的纤维部分达到较高程度的利用，那么16山东大学博士学位论文产生的乙醇相对于纤维性材料的利用率也不超过40，所以半纤维素生物利用的研究逐渐受到重视。木糖是半纤维素的主要组成部分，在植物纤维材料水解液中占30左右，是自然界中含量仅次子葡萄糖的第二丰富的糖类，因此木糖的利用是开发利用半纤维素的关键。近年来，以木糖为底物转化酒精的研究逐渐成为酒精途径工程研究的热点之一。表卜2各种生物质原料的组成TABLE12COMPOSITIONOFVARIOUSBIOMASSLAWMATEDALS一般地，对木质纤维素材料的生物利用的过程，包括酸H2S04，HCI或热的预处理；酸或各种纤维素酶、半纤维素酶的水解作用，最后是微生物发酵产生乙醇等物质。经过一个步骤同时完成水解糖化和发酵过程的工艺称为一步发酵法；而需要分别进行糖化和发酵的工艺称为二步发酵法。预处理是使木质纤维素材料液化；水解则是使多聚物断裂，释放出单糖用于发酵。酸水解需要在较高温度120“C160。C下进行，发酵前还需中和底物以适应微生物的PH条件，而山东人学博士学位论文酶水解作用需要多种酶参与，费用较高HAYNETAL1993；VOFLSIVERSETAL1995。相对于纤维素而言，半纤维素的生物降解是比较容易的，但其降解产物戊糖主要是木糖发酵产生乙醇则要比纤维素的降解产物葡萄糖的发酵困难的多。木质纤维素材料经预处理及水解作用后会产生大量对微生物发酵有害的物质，如乙酸、糠醛、乙醛以及木质素的降解物等，这些物质是微生物生长抑制因子，对乙醇发酵不利。大量研究表明酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAE对这些抑制因子的抗性较强LINDENETA11989；OLSSONETA11993；HAHNHAGERDALETA11994A，B。要得到较好的发酵木糖产生乙醇的微生物，有两个策略，一是从自然界中筛选天然利用木糖的微生物PAREKHETAL1986，1988；LINDENETAL1992；二是通过代谢工程手段改造微生物，使其利用并发酵木糖HALLBORNET以1991；WALFRIDSSONETAL1995，1996；OHTAETAL1990，1991A，199LB；KOTTERETAL1993；TANTIRUNGKIJETAL1993；ZHANGETAL1995。13木糖的代谢迄今为止已发现一百多种微生物能代谢木糖生成乙醇，包括细菌、真菌和酵母。自然界中主要的木糖发酵菌种见表L一3。自然界中由木糖转化为木酮糖的代谢途径有两条，其一，在某些利用木糖的酵母及丝状真菌中，木糖代谢途径首先是在依赖NADPH的木糖还原酶XRXYLOSEREDUCTASEECL1121的作用下还原木糖为木糖醇XYLIT01，随后在依赖NAD的木糖醇脱氢酶XDHXYLITOLDEHYDROGENASEEC1119作用下氧化形成木酮糖XYLULOSE，再经木酮糖激酶磷酸化形成5一磷酸木酮糖XYLULOSE一5PHOSPHATE，由此进入磷酸戊糖途径PPPPENTOSEPHOSPHATEDATHWAY。PPP途径中的氧化还原部分是NADPH的主要来源，而非氧化还原部分主要提供生物合成的前体物，如5一磷酸核糖用于合成核酸；4磷酸赤藓糖用于合成芳香族氨基酸。PPP途径的中间产物6。磷酸葡萄糖及3一磷酸甘油醛通过酵解途径形成丙酮酸，丙酮酸或是经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶脱羧还原为乙醇；或是通过TCA循环及呼吸链彻底氧化成C02，整个代谢过程见图11WALFRIDSSONPT以1995HAHNHAGERDALETAL1994A。大量研究表明，利用木糖的酵母菌发酵木糖产生乙醇时需要氧气，在厌氧环境中没有检测到乙醇SCHNEIDERETAL1981；生变查堂堡主兰堡堡苎WATSONETAL1984；LIGTHELMETAL1988；SKOOGELAL1988，1990。表13自然界中木糖发酵菌种TABLE13NATIVESTRAINSOFFERMENTINGXYLOSETOETHANOL菌种名称小糖乙醇得率产率型兰型兰型璺型细菌BACILLUSMACERANDMS1574BOCTEROIDE