GBT 18652-2002 致病性嗜水气单胞菌检验方法

r 18652致病性菌株和非致病性菌株之分。致病性菌株可感染鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类等动物，包括娜、团头舫、维、鳍、鲤、草鱼、香鱼、狼妒、虹缚、尼罗罗非鱼、斑点叉尾、黄鳝、日本鳗、欧洲鳗、翘嘴缘、牛蛙、美洲鳄、中华鳖、貉、兔、猪、牛等。临床上以急性出血性败血症为主要特征而发生腹泻及食物中毒。慢性感染则主要表现为皮肤溃疡或肠炎。人亦可因致病性嗜水气单胞菌感染本标准在嗜水气单胞菌的鉴定中，参考了伯杰氏鉴定细菌学手册)(第九版，1994)中有关嗜水气单胞菌的内容。在嗜水气单胞菌的分离鉴定中，除采用选择培养基养基外，还应借助一些生化反应将其与假单胞菌、邻单胞菌、肠杆菌、弧菌及其他气单胞菌进行区分。蛋白酶是嗜水气单胞菌重要的毒力决定因子，与该菌的致病性密切相关，凡蛋白酶阳性的嗜水气单胞菌均具致病性。蛋白酶的检测除采用脱脂奶平板法外，还可采用斑点酶联免疫试验。本标准可用于嗜水气单胞菌的分离鉴定，而且可区分致病性菌株和非致病性菌株，有助于致病性嗜水气单胞菌感染的确切诊断。本标准的附录A、附录录标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:南京农业大学动物医学院。本标准主要起草人:陆承平、陈怀青。中华人民共和国国家标准 18652of 标准适用于患病鱼类等易感动物及水样中致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定，也可用于送检菌株的鉴定。2致病性嗜水气单胞菌检验程序检验程序的流程示意图见附录C(提示的附录)。准的附录)。准的附录)2. 样及送检菌株，病料既可是无菌采取的易感动物的肾、肝、脾等未污染病料，也可是粪便或病变皮肤等污染病料，如样本为菌株，应先接种于普通肉汤(见附录) , 28'h，再划线接种于普通琼脂平板(见附录使之形成单个菌落，以供鉴定用。金耳)火焰灭菌，冷却。 28h,金耳)火焰灭菌，冷却。接种于附录2. 1. 8'h 用孔径为。. 2 取出滤膜，置含有灭菌碱性蛋白陈水(见附录试管中。8 28 8凸、圆整、无色或淡黄色，酸四甲基对苯胺(见附录滤纸片上。0 -,内观察细菌涂布处的颜色。为阳性。  穿刺接种附录3. 3  37h,部仍为紫色，底部为淡黄色;细菌沿穿刺线呈刷状生长，即运动力阳性;部分菌株顶部呈黑色。加3附录明产生叫噪，判为阳性。. 2用铂金耳取在载玻片上与蒸馏水混合并均匀涂布。焰固定。5. 5加草酸钱结晶紫染液(见附录1 6流水冲洗。附录用1 附录50 s,检。5. 12嗜水气单胞菌应为革兰氏阴性短杆菌。分别接种葡萄糖、蔗糖、阿拉伯搪、七叶昔及水杨昔等5种糖发醉试验管(见附录28h,明细菌可发酵该种糖类，判为阳性。5嗜水气单胞菌可发酵以上5种糖类。脂奶蔗糖胰蛋白脉平板(见附录r 186528培养24 h,明的溶蛋白圈，判为阳性2. 附录280 r/养48 4  10 000 r/上清。  37 N 20%脱脂奶中，37'h,附录5次，每次2 0兔抗嗜水气单胞菌蛋白酶抗血清中，37作用1 次2 0酶标羊抗兔抗血清中，37'h,次2 一二氨基联苯胺一过氧化氢(见附录显色。去离子水终止显色。试验结果分析判定符合以下特性者应判为致病性嗜水气单胞菌:a)在普通琼脂平板上，28培养24 凸、圆整、无色或淡黄色，有特殊芳香气味;b)在部仍为紫色，底部为淡黄色;细菌沿穿刺线呈刷状生长，即运动力阳性;部分菌株顶部呈黑色;c)氧化酶试验阳性，革兰氏染色为阴性短杆菌;d)叫噪试验阳性，发酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶昔及水杨昔等5种糖类;e)脱脂奶平板试验阳性或斑点酶联免疫试验阳性。 18652准的附录)各种培养基的配制方法0 0                      5. 0                1. 0 00 热溶解，调6，分装，112 刁，主牛肉膏蛋白陈抓化钠(酸二氢钾(琼脂蒸馏水混匀，加热溶解，00 装,112 却至45'3  拘摊酸铁胺脱氧胆酸钠氯化钠(酵母提取物新生霉素澳察香草酚兰琼脂蒸馏水混合溶解，调,煮沸16. 5 3 5 8 8 0 0 005 03 5 00 却至45C，倾注灭菌平板。蒸馏水10. 0  18652热溶解，装，112 0        0. 4 502 0 00 热溶解，调7，分装，112 6脱脂奶蔗箱胰蛋白膝平板10. 0 化钾(糖胰蛋白陈脱脂奶粉琼脂蒸馏水混匀，加热溶解，调。0分装，112 却至45'C，倾注灭菌平板。)抓化钾(糖胰蛋白陈脱脂奶粉蒸馏水馄匀，加热溶解，5 0 0 0 00 12  18652准的附录)各种试剂配制方法0 醇20 酸钱溶于蒸馏水80 用前将甲液和乙液混合。2. 0 8 h)碘化钾(馏水1. 0 0 醇0. 4 箱发酵试验管先配蛋白脉水(蛋白脉5. 0 g,蒸馏水1 000 装，每瓶100 mL)糖、阿拉伯糖、七叶昔及水杨昔1. 0 g，充分溶解，分装试,106. 44 吐温化钠(                      8. 0                       0. 2          H,            水定容至980 温0  18652,3一二氮基联苯胺一过妞化氮先配二经甲基氨基甲烷一盐酸(冲液(抓化钠8. 0 g,氛化钾。.2 g, g,蒸馏水800 4，加水定容至1